3D激光掃描顯微鏡下牙本質(zhì)齲微結(jié)構(gòu)的觀察和分析
作者：許立俠 徐紅梅 朱曉英孫麗梅
作者單位：武警總醫(yī)院口腔科，北京 100039
[摘要] 目的 通過(guò)3D激光掃描顯微鏡觀察牙本質(zhì)齲的微結(jié)構(gòu)，為臨床上齲病的防治及相關(guān)研究提供形態(tài)學(xué)理論依據(jù)。方法 收集6顆新鮮拔除的有齲壞的第三磨牙，均制備成橫剖面標(biāo)本，在3D激光掃描顯微鏡下進(jìn)行光學(xué)、激光彩色及3D形貌圖的觀察。結(jié)果 在樣本整體結(jié)構(gòu)中，光鏡下可見(jiàn)病變組織的輪廓，激光彩色鏡下較清晰分辨兩層牙本質(zhì)病變；在微結(jié)構(gòu)中，激光彩色圖下可以觀察到透明層牙本質(zhì)小管部分閉合，脫礦層管周和管間牙本質(zhì)數(shù)目較少，細(xì)菌侵入層管周和管間牙本質(zhì)均破壞，相鄰小管融合，呈串珠樣和橢圓形病灶，壞死崩解層無(wú)正常牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)。3D形貌圖下可根據(jù)顏色的不同觀察到四層結(jié)構(gòu)。結(jié)論3D激光掃描顯微鏡能夠分辨牙本質(zhì)齲的兩層病變組織結(jié)構(gòu)，觀察到牙本質(zhì)四層結(jié)構(gòu)中牙本質(zhì)小管、管周、管間牙本質(zhì)的不同改變，是觀察牙本質(zhì)微結(jié)構(gòu)的有力工具。同時(shí)牙本質(zhì)齲微結(jié)構(gòu)的形態(tài)對(duì)臨床上齲病的防治及相關(guān)研究具有理論指導(dǎo)意義。
[關(guān)鍵詞] 牙本質(zhì)齲； 3D激光掃描顯微鏡； 小管； 微結(jié)構(gòu)
牙本質(zhì)是位于釉質(zhì)和牙髓之間的夾層結(jié)構(gòu)，富含牙本質(zhì)小管，當(dāng)牙本質(zhì)齲壞病變時(shí)，小管結(jié)構(gòu)的改變尤為突出。研究者們根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)方法的不同將牙本質(zhì)齲壞分為不同層次。Ogushi等[1]將牙本質(zhì)齲分為內(nèi)外兩層：外層為細(xì)菌感染層，無(wú)機(jī)物脫礦，有機(jī)物分解，不能再礦化，臨床上應(yīng)該徹底去除；內(nèi)層無(wú)細(xì)菌，無(wú)機(jī)物稍微脫礦，有機(jī)物未分解，可以再礦化，臨床上可以保留。而現(xiàn)在多數(shù)學(xué)者[2]將牙本質(zhì)齲的病變?cè)诮M織學(xué)上由病損深部向表面分為透明層、脫礦層、細(xì)菌侵入層和壞死崩解層。還有的學(xué)者[3]將牙本質(zhì)齲變層描述為粉色、淡粉色、透明色和基本正常。但每一層的微結(jié)構(gòu)變化均不同。早期對(duì)于牙本質(zhì)齲病結(jié)構(gòu)的觀察是通過(guò)透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）[4]，近年來(lái)原子力顯微鏡的應(yīng)用較為普遍，但這些方法均有不足。TEM觀察前需對(duì)標(biāo)本脫水及真空處理會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)的改變，且僅能以黑白色進(jìn)行觀察，不能夠反映樣本的真實(shí)結(jié)構(gòu)。原子力顯微鏡雖能夠反映樣本的真實(shí)結(jié)構(gòu)，但要求標(biāo)本的表面光滑細(xì)致，且掃描圖貌耗時(shí)長(zhǎng)。3D激光掃描顯微鏡作為微納米科學(xué)研究的重要工具之一，近年來(lái)在口腔生物材料的研究領(lǐng)域中獲得了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的青睞[5]。本文運(yùn)用3D激光掃描顯微鏡對(duì)牙本質(zhì)齲整體和局部微結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為研究牙本質(zhì)齲的相關(guān)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，也對(duì)臨床上牙本質(zhì)淺齲的再礦化治療提供一定的形態(tài)學(xué)理論依據(jù)。
1 材料和方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備
Hank’s平衡鹽溶液[6]（Hanks balanced salt solution，HBSS）：400 mg·L-1KCl、60 mg·L-1 KH2PO4、8 000 mg·L-1 NaCl、1 000 mg·L-1葡萄糖、90 mg·L-1 Na2HPO4·7H2O、350 mg·L-1 NaHCO3、140 mg·L-1CaCl2、100 mg·L-1 MgSO4·7H2O和100 mg·L-1 MgCl2·6H2O；3D激光掃描顯微鏡（Keyence公司，日本）。
1.2 離體牙的收集
收集武警總醫(yī)院口腔頜面外科拔出的新鮮第三磨牙，從中挑選出6顆平滑面齲（圖1）。
齲壞均為白堊色，患者年齡20~35歲，患者均知情同意并簽署同意書。去離子水下用潔牙機(jī)超聲清洗表面軟組織和牙石，沖洗干凈后置于HBSS溶液中4 ℃保存?zhèn)溆茫?周內(nèi)使用。
1.3 牙齒標(biāo)本的制備
將收集的離體牙用硬組織切割機(jī)將牙體組織通過(guò)病變區(qū)域沿中線縱切，暴露出牙本質(zhì)齲變橫剖面（圖1）。然后用環(huán)氧自凝樹脂包埋各牙齒并標(biāo)記，拋光機(jī)及240、320、600、800、1 000號(hào)碳化硅砂紙?jiān)诹魉乱来文テ健伖夂?，超聲下振蕩清? min，沖洗吹干后在3D激光掃描顯微鏡下進(jìn)行光學(xué)顯微、激光彩色及3D形貌圖的觀察比較。
2 結(jié)果
2.1 牙本質(zhì)齲整體結(jié)構(gòu)的形貌觀察圖
在光學(xué)顯微形貌圖中（200倍和400倍）可以觀察到病變組織由釉質(zhì)齲沿釉牙本質(zhì)界擴(kuò)展而來(lái)的牙本質(zhì)齲的大體輪廓，外層顏色較深，而內(nèi)層顏色稍淡。但在1 000倍下形貌分層模糊不清。在激光彩色形貌圖中可清晰地觀察到齲壞病變分為兩層，1000倍下分層明確，牙本質(zhì)小管也清晰可見(jiàn)，牙本質(zhì)小管大多管腔開口，散落在整個(gè)牙本質(zhì)中；也有呈管束狀的牙本質(zhì)小管（圖2）。
2.2 牙本質(zhì)齲微結(jié)構(gòu)的激光彩色圖
在3 000倍下的激光彩色圖中可以觀察到牙本質(zhì)齲四層微結(jié)構(gòu)的變化（圖3）。正常牙本質(zhì)小管管腔清晰，管周牙本質(zhì)明顯，管間牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)完整（圖3a）。位于牙本質(zhì)齲最深層的透明層，牙本質(zhì)小管變窄，有的完全阻塞（圖3b）；透明層表面的脫礦層，牙本質(zhì)小管形態(tài)較完整，管周牙本質(zhì)和管間牙本質(zhì)數(shù)目減少，管周可見(jiàn)較大的白色礦物質(zhì)沉積物（圖3c）；近脫礦層的細(xì)菌侵入層，局部小管管壁膨脹，擴(kuò)張變形，管周牙本質(zhì)被壓迫，管間牙本質(zhì)破壞，相鄰小管相互融合，呈串珠樣結(jié)構(gòu)。病變進(jìn)一步進(jìn)展，被破壞的小管進(jìn)一步融合，形成橢圓形的液化壞死灶（紅色彎曲箭頭所示）；釉牙本質(zhì)界處的壞死崩解層，幾乎無(wú)正常牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)，完全崩解破壞，為全黑色空隙，齲洞從釉牙本質(zhì)界處形成。
2.3 牙本質(zhì)齲微結(jié)構(gòu)全貌3D形貌圖
1 000倍下以3D格式顯示激光彩色形貌圖，以不同顏色顯示3D圖像的色階，左側(cè)顏色條顯示與顏色對(duì)應(yīng)的高度值，紅色光標(biāo)（用于上限）和藍(lán)色光標(biāo)（用于下限）。牙本質(zhì)從釉牙本質(zhì)界處到健康牙本質(zhì)組織的顏色由藍(lán)色向紅色過(guò)渡，即高度由低向高過(guò)渡；釉質(zhì)牙本質(zhì)界處組織凹陷，以藍(lán)色居多，高度較低（圖4）。
2.4 牙本質(zhì)齲微結(jié)構(gòu)局部3D形貌圖
3 000倍下以3D格式顯示的激光彩色形貌圖更立體形象地顯示了各層牙本質(zhì)齲變及微結(jié)構(gòu)的形態(tài)變化。同樣以不同顏色顯示3D圖像的色階，紅色區(qū)域可代表正常牙本質(zhì)，淡紅色和橙黃色區(qū)域可代表牙本質(zhì)齲的內(nèi)層即透明層和脫礦層，黃綠色區(qū)域和藍(lán)色及尖峰狀區(qū)域可代表牙本質(zhì)齲的外層即細(xì)菌侵入層和壞死崩解層（圖5）。
3 討論
3.1 3D激光掃描顯微鏡的成像原理
3D激光掃描顯微鏡以微納米尺度對(duì)樣品三維表面形貌進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量精度可達(dá)到0.001 μm。其成像原理采用了“激光光源”和“白色光源”2路光源方式。通過(guò)這2個(gè)光源獲得構(gòu)建彩色全焦點(diǎn)圖像、激光全焦點(diǎn)圖像、高低圖像所必要的色彩、光量、高度的信息。首先通過(guò)短波長(zhǎng)激光檢測(cè)反射光量和高度。從激光顯微系統(tǒng)的激光光源發(fā)出的光線經(jīng)由XY掃描光學(xué)系統(tǒng)、接物透鏡聚光至對(duì)象物體上。聚光后的點(diǎn)光源通過(guò)XY掃描光學(xué)系統(tǒng)在觀察視野內(nèi)進(jìn)行面掃描。在觀察視野內(nèi)分割成1 024×768像素運(yùn)行掃描，并由受光組件檢測(cè)各像素的反射光。將接物透鏡在Z軸方向上驅(qū)動(dòng)，反復(fù)運(yùn)行面掃描，獲得各像素的各Z軸位置處的反射光量。將反射光量最高的Z軸位置設(shè)為焦點(diǎn)，檢測(cè)高度信息和反射光量。這樣便可獲得整體對(duì)焦的光量全焦圖像和高低圖像信息。其次，使用彩色電荷耦合器件（Charge Coupled Device，簡(jiǎn)稱CCD攝像機(jī)）檢測(cè)白光源的發(fā)射光。CCD攝像機(jī)在每個(gè)像素的基礎(chǔ)上，使用激光束獲取焦點(diǎn)位置的顏色信息。前期實(shí)驗(yàn)應(yīng)用3D激光顯微鏡觀察到早期釉質(zhì)齲的納米結(jié)構(gòu)，釉柱頭部晶體變大，釉質(zhì)間隙增寬，釉柱鞘連續(xù)性中斷等顯著變化[7]。
3.2 牙本質(zhì)齲微結(jié)構(gòu)形態(tài)的分析
由于點(diǎn)隙窩溝解剖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，會(huì)干擾齲變的形態(tài)學(xué)研究，所以本實(shí)驗(yàn)以平滑面齲為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。牙本質(zhì)齲多是由釉質(zhì)齲進(jìn)一步向深層發(fā)展而來(lái)，部分也可由牙根部牙骨質(zhì)齲發(fā)展所致。牙本質(zhì)全層存在牙本質(zhì)小管，齲損沿釉牙本質(zhì)界擴(kuò)散，同時(shí)沿牙本質(zhì)小管進(jìn)展，病程較快。牙本質(zhì)齲中小管的改變較為突出，是研究牙本質(zhì)齲病變的主要分析對(duì)象。
在整體結(jié)構(gòu)中，光學(xué)顯微鏡下僅能在低倍鏡下觀察到病變組織的大體輪廓，高倍鏡下分層結(jié)構(gòu)模糊不清，微結(jié)構(gòu)改變更是難以辨識(shí)。而在激光彩色圖貌中，不僅低倍鏡下病變組織分層明確，高倍鏡下牙本質(zhì)小管清晰可見(jiàn)，病變組織處的牙本質(zhì)小管數(shù)目減少，釉牙本質(zhì)界處齲損也很明確。
在微結(jié)構(gòu)中，激光彩色形貌圖可清晰地觀察到牙本質(zhì)小管、管周牙本質(zhì)、管間牙本質(zhì)等微結(jié)構(gòu)的變化。接近正常組織的透明層牙本質(zhì)小管管腔變窄，部分小管完全阻塞。而近透明層處仍可見(jiàn)正常牙本質(zhì)小管，管周牙本質(zhì)明顯，管間牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)完整。透明層又稱為硬化層，是牙本質(zhì)齲最早出現(xiàn)的改變，由于牙本質(zhì)小管管腔中有礦物質(zhì)沉積，使小管管腔變窄，隨著礦物質(zhì)沉積增多，最終將牙本質(zhì)小管管腔完全阻塞。Ogawa等[8]在顯微硬度分析中發(fā)現(xiàn)，此層硬度和正常牙本質(zhì)相比較低，表明透明層存在一定的脫礦。本實(shí)驗(yàn)觀察到管周和管間牙本質(zhì)的無(wú)機(jī)物降解現(xiàn)象，而激光彩色（光學(xué)）形貌圖是一種在測(cè)量后用激光強(qiáng)度圖像和光學(xué)圖像合成的全幅對(duì)焦光學(xué)圖像，用顏色對(duì)各高度像素進(jìn)行標(biāo)示，由CCD相機(jī)按每1像素分別提取，再轉(zhuǎn)換成激光高分辨率圖像。牙體組織的脫礦、礦物質(zhì)溶解等可能導(dǎo)致牙本質(zhì)表面高度的改變，從而在激光彩色形貌圖中體現(xiàn)出顏色的改變。脫礦層中牙本質(zhì)小管的形態(tài)較完整，但直徑相對(duì)變大，管周和管間牙本質(zhì)數(shù)目減少，說(shuō)明存在脫礦現(xiàn)象。有部分管周牙本質(zhì)小管有白色較大礦物質(zhì)沉積，表明同時(shí)存在再礦化現(xiàn)象[9]。而在臨床上洞型制備時(shí)是否保留此層深部質(zhì)硬的牙本質(zhì)一直存在爭(zhēng)議。Iwami等[10]研究表明脫礦層雖已脫礦軟化，但部分軟化牙本質(zhì)是無(wú)菌的。Besinis等[11]研究也表明軟化牙本質(zhì)可再礦化。此外，保存此層牙本質(zhì)并隨后充填，即使存在一些受感染的牙本質(zhì)，只要充填物保持完整，病變即不會(huì)進(jìn)展。因此在脫礦層軟化牙本質(zhì)深方質(zhì)硬且著色的牙本質(zhì)在洞型制備時(shí)不需去除。而馮希平[12]在牙體充填后繼發(fā)齲的產(chǎn)生和預(yù)防中總結(jié)出絕大多數(shù)充填體再次充填是因?yàn)樵l(fā)性齲病，因此認(rèn)為應(yīng)將這些軟化牙本質(zhì)徹底去除。細(xì)菌侵入層可觀察到小管管壁腫脹、擴(kuò)張變形，相鄰小管相互融合，呈串珠樣外觀等破壞輕微的現(xiàn)象。同時(shí)可看到被破壞的小管進(jìn)一步融合，形成橢圓形壞死灶等破壞較嚴(yán)重的階段。造成細(xì)菌侵入層現(xiàn)象的原因是由于細(xì)菌侵入，小管內(nèi)細(xì)菌大量繁殖，小管壁脫礦，蛋白溶解，局部小管由于細(xì)菌團(tuán)塊的增加，管壁膨脹擴(kuò)張變形，管周牙本質(zhì)首先被壓迫，隨后壓迫管間牙本質(zhì)，隨著管周和管間牙本質(zhì)的脫礦加劇，膠原纖維變性分解，管周牙本質(zhì)破壞，相鄰小管融合呈串珠樣外觀。病變進(jìn)一步發(fā)展，被破壞的小管持續(xù)融合，形成橢圓形的壞死灶。此層內(nèi)有細(xì)菌感染，臨床上應(yīng)該徹底清除。在壞死崩解層，幾乎無(wú)正常牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)，釉牙本質(zhì)界處齲洞形成。
透明層、脫礦層、細(xì)菌侵入層、壞死崩解層的形成是一種動(dòng)態(tài)的過(guò)程，很難具體劃分界限，而3D激光掃描顯微鏡記錄一個(gè)樣品在最大光強(qiáng)度時(shí)每個(gè)像素的光電倍增管激光強(qiáng)度數(shù)據(jù)和實(shí)際高度數(shù)據(jù)（一種內(nèi)置光學(xué)線性刻度值）。以不同顏色顯示3D圖像的色階，顏色色階對(duì)應(yīng)相應(yīng)的高度值。3D顯示時(shí)，能夠以立體鏡方式查看圖像。牙本質(zhì)齲中礦物質(zhì)溶解，可能會(huì)使牙本質(zhì)表面高低發(fā)生改變。因此在3D形貌圖中，可以通過(guò)顏色的不同大體區(qū)分不同組織病變，而且立體形象。紅色區(qū)域可代表正常牙本質(zhì)；牙本質(zhì)齲的內(nèi)層即透明層和脫礦層，脫礦程度較輕微，可呈現(xiàn)出淡紅色和橙黃色；黃綠色區(qū)域和藍(lán)色及尖峰狀區(qū)域可代表牙本質(zhì)齲的外層即細(xì)菌侵入層和壞死崩解層，齲壞脫礦較嚴(yán)重。
綜上所述，本研究應(yīng)用3D激光掃描顯微鏡可以觀察到牙本質(zhì)齲四層牙本質(zhì)小管、管周和管間牙本質(zhì)等微結(jié)構(gòu)的不同改變，進(jìn)一步驗(yàn)證了內(nèi)層即透明層和脫礦層，雖有少量微結(jié)構(gòu)脫礦，但存在再礦化現(xiàn)象，為進(jìn)一步研究牙本質(zhì)齲的相關(guān)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，也對(duì)臨床上牙本質(zhì)淺齲的再礦化治療提供了形態(tài)學(xué)理論依據(jù)。
來(lái)源：《華西口腔醫(yī)學(xué)雜志》2016年10月第34卷第5期
