[摘要]  牙周炎是以牙周組織破壞為特征的感染性疾病，作為重要的牙周組織再生種子細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在重構(gòu)牙周組織結(jié)構(gòu)和功能、促進(jìn)牙周病好轉(zhuǎn)乃至愈合方面具有重要作用，因此骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特性尤其是其成骨分化的相關(guān)調(diào)控機(jī)制是目前研究熱點(diǎn)之一。BMAL1基因與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化等諸多生理行為的調(diào)控關(guān)系密切，有望成為牙周疾病新的治療靶點(diǎn)。本文對(duì)BMAL1基因的特性以及調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的機(jī)制作一綜述。

[關(guān)鍵詞]  BMAL1基因；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 成骨分化； 牙周炎

慢性牙周炎已成為最常見(jiàn)的口腔慢性疾病之一，牙周袋形成和牙槽骨吸收是慢性牙周炎的主要臨床特征。牙槽骨的慢性喪失與機(jī)體成骨能力的退化密切相關(guān)，主要來(lái)源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成骨向分化的成骨細(xì)胞是骨形成的重要細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，增齡、炎癥等因素均可影響B(tài)MSCs的分化和增殖能力，使成骨細(xì)胞生成數(shù)量下降，最終導(dǎo)致骨形成顯著減少[1-2]，這也是糖尿病加速牙周炎發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一。BMAL1基因是近日節(jié)律基因的重要成員，BMAL1基因的活性與諸多基因表達(dá)和血糖代謝等生物行為活動(dòng)的節(jié)律性密切相關(guān)，更與BMSCs的成骨分化直接相關(guān)[3]，但是其調(diào)控機(jī)制尚不明確。因此，探究BMAL1基因調(diào)控BMSCs成骨分化的機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上逆向調(diào)控，促進(jìn)BMSCs成骨分化，防止骨組織的退行性改變，促進(jìn)慢性牙周炎的好轉(zhuǎn)乃至愈合成為研究的熱點(diǎn)。本文對(duì)BMAL1基因在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中可能發(fā)揮的調(diào)控作用及機(jī)制作一綜述。

1  BMSCs是牙周組織再生、促進(jìn)慢性牙周炎愈合的基礎(chǔ)

慢性牙周炎是以菌斑為始動(dòng)因子，牙齦、牙槽骨、牙周膜等牙周組織破壞為特征的慢性炎癥性疾病。盡管包括牙周基礎(chǔ)治療在內(nèi)的牙周序列治療可以有效地控制菌斑、消除炎癥，但是只能延緩牙周組織的吸收破壞，難以修復(fù)已缺損的組織；而目前較流行的引導(dǎo)組織再生術(shù)，只能部分再生牙周組織，不能實(shí)現(xiàn)牙周組織的生理和功能性再生[4]。組織程技術(shù)的出現(xiàn)為牙周組織再生和牙周疾病的治療提供了新的研究思路，其核心要素是具有多向分化潛能的種子細(xì)胞。相較于牙周膜干細(xì)胞等牙源性干細(xì)胞，BMSCs在牙周組織再生治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。研究[5]發(fā)現(xiàn)，BMSCs具有免疫調(diào)節(jié)功能，可減少炎性因子的產(chǎn)生和定向遷移，還可直接或間接發(fā)揮抗菌和保護(hù)組織的功能，最近還有研究[6]證實(shí)，炎性狀態(tài)下BMSCs較牙周膜干細(xì)胞具有更強(qiáng)的成骨分化能力。因此，BMSCs是牙周組織再生技術(shù)中主要的干細(xì)胞來(lái)源，探索BMSCs成骨分化的調(diào)控機(jī)制，提高其成骨效率，促進(jìn)牙槽骨結(jié)構(gòu)和功能重建已成為研究的熱點(diǎn)。

2  BMAL1基因是機(jī)體生理活動(dòng)的重要調(diào)節(jié)因子

生物鐘存在于機(jī)體大部分組織和細(xì)胞內(nèi)，是調(diào)節(jié)體內(nèi)能量平衡和代謝等生理活動(dòng)的重要因素[7]。節(jié)律基因主要包括BMAL1基因、生物鐘循環(huán)輸出蛋白（circadian locomoter output cycle kaput，CLOCK）、周期基因家族（Period，Per，包括Per1、Per2和 Per3）、隱花色素家族（Cryptochrome，Cry，包括Cry1和Cry2）、神經(jīng)PAS結(jié)構(gòu)域蛋白2等，其中BMAL1基因是機(jī)體生物鐘的核心組件，在視交叉上核和外周組織如長(zhǎng)骨、造血干細(xì)胞乃至整個(gè)骨髓中均有表達(dá) ，其常與CLOCK基因形成二聚復(fù)合體后結(jié)合到Per或Cry基因的啟動(dòng)子上對(duì)其轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控，而Per或 Cry轉(zhuǎn)錄翻譯后又反饋抑制BMAL1/CLOCK二聚體的形成，從而起到調(diào)控生物近日節(jié)律的作用[8]。BMAL1基因的節(jié)律性表達(dá)可以使執(zhí)行其功能的BMAL1蛋白周期性表達(dá)[9]，因此受其影響的下游基因也產(chǎn)生節(jié)律性表達(dá)， 從而對(duì)體內(nèi)的一系列生理生化反應(yīng)產(chǎn)生影響。

機(jī)體節(jié)律的紊亂，特別是BMAL1基因表達(dá)水平的降低會(huì)導(dǎo)致腫瘤和代謝綜合征的發(fā)生[10-11]。例如BMAL1基因與糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。BMAL1基因參與調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞的節(jié)律性分泌[12]，BMAL1基因缺失可以導(dǎo)致小鼠的晝夜節(jié)律完全喪失，體內(nèi)血糖水平的節(jié)律性振蕩發(fā)生紊亂甚至消失[13]，從而導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生或惡化。BMAL1基因突變會(huì)使小鼠胰島中與細(xì)胞生長(zhǎng)、突觸囊泡裝配相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化，從而使小鼠表現(xiàn)出糖耐量受損、胰島素分泌減少以及胰島細(xì)胞形態(tài)和增殖異常等改變，并且隨著年齡的增長(zhǎng)，癥狀逐漸惡化[14]。近年來(lái)研究[15]證實(shí)，BMAL1-/-小鼠中BMAL1基因的靶基因抗氧化調(diào)節(jié)因子-核因子NF-E2相關(guān)因子（nuclear factor erythroid 2-related factor，Nrf2）表達(dá)減弱，胰島β細(xì)胞中活性氧（reactiveoxygen species，ROS）和順向線(xiàn)粒體解偶聯(lián)大量積累，細(xì)胞內(nèi)氧化平衡被打破，胰島素分泌減少。也有研究[16]認(rèn)為，BMAL1-/-鼠中線(xiàn)粒體脫偶聯(lián)蛋白2（uncouplingproteins，UCP2） 增加，導(dǎo)致β細(xì)胞線(xiàn)粒體破壞，胰島素分泌動(dòng)力不足，從而導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生 。眾所周知，糖尿病是慢性牙周炎的全身促進(jìn)因素，糖尿病性牙周炎患者牙槽骨吸收速度快、病情嚴(yán)重，這可能與糖尿病環(huán)境下 BMSCs的成骨分化能力受到明顯抑制有關(guān)。研究[17]顯示，糖尿病大鼠BMSCs的增殖和成骨分化能力明顯下降。Kim等[18]將患有妊娠期糖尿病的孕婦與健康孕婦比較，發(fā)現(xiàn)妊娠期糖尿病患者臍周血BMSCs的活性和成骨分化能力受到明顯抑制。這一現(xiàn)象與多種通路和因子有關(guān)，例如可能與受損的胰島素和胰島素生長(zhǎng)因子1通路抑制BMSCs的增殖和成骨分化有關(guān)[19]，也可能是因?yàn)樘悄虿…h(huán)境下細(xì)胞內(nèi)ROS的大量堆積激活PI3K/Akt通路抑制BMSCs成骨分化[20]，并且糖尿病患者經(jīng)胰島素治療后可部分恢復(fù)BMSCs的成骨分化能力[21]。因此，BMAL1基因是血糖代謝調(diào)控和BMSCs成骨分化調(diào)控的結(jié)合點(diǎn)，而在糖尿病環(huán)境下BMAL1基因?qū)MSCs的增殖和成骨分化的調(diào)控機(jī)制尚沒(méi)有明確結(jié)論，成為當(dāng)前糖尿病性牙周炎研究的熱點(diǎn)。

3  BMAL1基因是調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的重要因子

BMAL1基因在BMSCs成骨分化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。相較于野生型小鼠，BMAL1-/-小鼠過(guò)早表現(xiàn)出諸如BMSCs成骨能力下降、牙槽骨缺損等早熟現(xiàn)象，而提 高BMAL1-/-小鼠中BMAL1基因的表達(dá)水平后，BMSCs的增殖和分化能力會(huì)得到一定程度的修復(fù)[22]。BMAL1基因可能通過(guò)兩種方式影響骨的形成，一種方式是影響可分化為成骨細(xì)胞的BMSCs的增殖[23]，另一種方式是直接作用于骨形成的某個(gè)階段。隨著B(niǎo)MSCs老化，其增殖分化能力和細(xì)胞中BMAL1基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)出高度一致的下降趨勢(shì)，BMSCs增殖和成骨分化能力的下降，最終會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)流失[24-25]；而人為抑制BMAL1基因正向調(diào)節(jié)因子視黃酸相關(guān)孤兒受體（retinoid-related orphan receptors，RORs）的活性，會(huì)導(dǎo)致牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白和骨涎蛋白代謝的下降[26]。

綜上，BMAL1基因作用廣泛，常與同家族的CLOCK基因形成復(fù)合體發(fā)揮作用，與多種細(xì)胞因子的代謝密切相關(guān)，并可通過(guò)多種機(jī)制調(diào)節(jié)BMSCs的成骨分化。

4  BMAL1基因調(diào)控BMSCs成骨分化的可能機(jī)制

4.1  通過(guò)Wnt信號(hào)通路影響B(tài)MSCs成骨分化

Wnt通路是調(diào)控干細(xì)胞增殖和多向分化的關(guān)鍵途徑，是目前已知的和BMSCs骨向分化關(guān)系最密切的信號(hào)通路之一。Wnt信號(hào)通路以是否有β連環(huán)蛋白（β-catenin）參與而分為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路和非經(jīng)典信號(hào)通路。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路和非經(jīng)典信號(hào)通路均在BMSCs骨向分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并且兩者之間還相互影響，例如Wnt3a對(duì)BMSCs增殖有促進(jìn)作用，而Wnt5a可通過(guò)非經(jīng)典途徑拮抗Wnt3a的作用[27]。經(jīng)典Wnt通路在BMSCs成骨分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，可通過(guò)上調(diào)成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osterix等促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，還可以通過(guò)減少脂肪形成轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)抑制BMSCs的脂向分化[28]。針對(duì)非經(jīng)典信號(hào)通路的研究還較少，研究發(fā)現(xiàn)非經(jīng)典信號(hào)通路配體Wnt5可下調(diào)成脂標(biāo)志物過(guò)氧化物酶體增殖受體的表達(dá)，從而促進(jìn)干細(xì)胞由成脂向成骨分化轉(zhuǎn)變[29]。

BMAL1基因已被發(fā)現(xiàn)與Wnt信號(hào)通路的功能以及其成員的表達(dá)和代謝密切相關(guān)。在BMSCs成骨分化過(guò)程中，特別是在成骨誘導(dǎo)7 d后，BMAL1基因與Wnt信號(hào)通路發(fā)揮高度一致的協(xié)同作用[30]。目前針對(duì)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的核心因子β-catenin與BMAL1基因的研究較多，但仍處于現(xiàn)象描述階段，在BMSCs成骨分化過(guò)程中BMAL1基因調(diào)控β-catenin的可能機(jī)制還有待深入研究。Zhang等[31]證實(shí)， β-catenin的表達(dá)隨著年齡增長(zhǎng)逐漸下降，與BMAL1基因的變化規(guī)律相近。在BMAL1基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，β-catenin的表達(dá)明顯增強(qiáng)[32]，但是其機(jī)制尚未明確，可能與減少β-catenin的降解有關(guān)[33-35]。關(guān)于BMAL1基因?qū)Ζ?catenin轉(zhuǎn)錄促進(jìn)作用的研究很少，這是因?yàn)榭赡苓€有其他因素參與了BMAL1基因?qū)Ζ?catenin的表達(dá)調(diào)控[32]，例如RORs在BMAL1基因促進(jìn)β-catenin轉(zhuǎn)錄過(guò)程中可能發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[26]。因此盡管已有研究[27]證明，β-catenin是BMAL1基因的靶基因，二者通過(guò)啟動(dòng)子上的一段順式作用元件E-box結(jié)合而發(fā)揮作用，但在BMSC成骨分化過(guò)程中厘清二者相互作用的具體機(jī)制是研究的難點(diǎn)。針對(duì)BMAL1基因與Wnt通路其他成員（配體和受體）關(guān)系的研究還較少，Janich等[36]研究發(fā)現(xiàn)，BMAL1-/-鼠中包括Lef1和Wnt10a在內(nèi)的多種Wnt相關(guān)基因的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，但是具體機(jī)制尚不明確，因此BMAL1基因如何調(diào)控Wnt配體或受體的表達(dá)需要進(jìn)一步的研究。

4.2  影響Runx2表達(dá)調(diào)控BMSCs成骨分化

Runx2是已知的骨形成過(guò)程中不可或缺的轉(zhuǎn)錄因子之一，具有引導(dǎo)BMSCs骨向分化、抑制其成軟骨和成脂向分化的作用。Runx2敲除鼠可表現(xiàn)出明顯的成骨分化異常，反之Runx2的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)BMSCs的成骨分化。Runx2以及若干下游靶基因在骨組織中呈現(xiàn)出具有晝夜節(jié)律性的表達(dá)特點(diǎn)，并且在骨生成以及BMSCs成骨分化過(guò)程中Runx2和以BMAL1基因?yàn)榇淼墓?jié)律基因之間具有密切的相互關(guān)系[37]。盡管有研究證實(shí)Runx2啟動(dòng)子上有一固定片段5-CACATG-3’是Myc家族的結(jié)合位點(diǎn)，且與BMAL1基因結(jié)合位點(diǎn)E-box片段（5’-CACGTG-3’）相近，但BMAL1基因是否通過(guò)該片段調(diào)控RUNX2的表達(dá)需要進(jìn)一步的研究[38]。BMAL1基因除了直接調(diào)控Runx2的表達(dá)，還可以通過(guò)影響轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor β，TGF-β）等多種因子和通路間接調(diào)控Runx2的表達(dá)[39]。BMAL1基因與Runx2之間的關(guān)系還有待更深入的研究。

4.3  通過(guò)p53/p21信號(hào)通路途徑調(diào)控BMSCs成骨分化

牙槽骨增齡性萎縮與BMSCs凋亡和成骨分化能力的下降密切相關(guān)。BMSCs衰老和凋亡受到p53/p21信號(hào)通路的調(diào)控，并且該通路核心因子p53可以通過(guò)激活microRNA-34抑制Runx2的轉(zhuǎn)錄，從而影響B(tài)MSCs的成骨分化[40]。p53的表達(dá)受到BMAL1基因的調(diào)控，BMAL1基因表達(dá)降低會(huì)使中樞生物鐘-交感神經(jīng)-外周組織生物鐘軸失調(diào)[41]，而后者起到抑制p53表達(dá)的作用，由此可見(jiàn)BMAL1基因可通過(guò)影響p53的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)BMSCs成骨分化的調(diào)控作用。

BMAL1基因還深度介入炎癥免疫的調(diào)控，與單核細(xì)胞[42]、TGF-β[43]等多種炎癥細(xì)胞和因子的增殖、表達(dá)密切相關(guān)，推測(cè)BMAL1基因可以通過(guò)對(duì)后者的調(diào)控間接實(shí)現(xiàn)對(duì)BMSCs成骨分化的影響。

目前對(duì)于BMAL1基因如何調(diào)控BMSCs成骨分化的研究較少，這可能是因?yàn)椋?）BMAL1基因與多種生理或病理現(xiàn)象相關(guān)，并且參與多種信號(hào)通路，與若干因子形成了錯(cuò)綜復(fù)雜的直接或間接影響B(tài)MSCs成骨分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，因此厘清BMAL1基因調(diào)控BMSCs成骨分化的機(jī)制尚有一定的難度；2）BMAL1基因常與同家族的CLOCK基因形成二聚體后才發(fā)揮相應(yīng)效應(yīng)，這也在一定程度上阻礙了對(duì)BMAL1基因功能的認(rèn)識(shí)。

以BMSCs為主要細(xì)胞來(lái)源的牙周組織再生技術(shù)在促進(jìn)牙槽骨再生、加速牙周疾病的好轉(zhuǎn)乃至愈合等方面發(fā)揮著獨(dú)特的作用[44]，為重建牙周組織正常結(jié)構(gòu)創(chuàng)造了可能。BMAL1基因可能參與炎癥免疫、血糖代謝和BMSCs成骨分化的調(diào)控，通過(guò)對(duì)BMAL1基因調(diào)控BMSCs成骨分化相關(guān)機(jī)制的研究，將為尋找牙周疾病治療的新靶點(diǎn)、重建牙周組織的形態(tài)和功能提供新的途徑。

來(lái)源：《華西口腔醫(yī)學(xué)雜志》2016年6月第34卷第3期