來源：《華西口腔醫(yī)學(xué)雜志》2017年4月第35卷第2期

作者：章可可，周學(xué)東，徐欣

作者單位：口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家口腔疾病臨床研究中心，四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院，成都610041

[摘要]  過氧化氫（H2O2）作為口腔中一種重要的抑菌物質(zhì)，在口腔微生態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用。在口腔齦上菌斑定植的先鋒菌中，約有80%細(xì)菌屬于口腔鏈球菌屬，這些口腔鏈球菌可以利用不同的氧化酶合成H2O2，同時(shí)H2O2可通過抑制對H2O2敏感的微生物參與菌間競爭拮抗，使氧耐受菌得以存活，從而調(diào)節(jié)生物膜的發(fā)展過程；H2O2還可通過影響微生物細(xì)胞外DNA的釋放和感受態(tài)細(xì)胞的形成進(jìn)而影響基因的水平轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)生物膜對口腔環(huán)境的適應(yīng)能力；同時(shí)口腔微生物也可通過一系列機(jī)制耐受H2O2。此外，H2O2在微生物與宿主的關(guān)系中也發(fā)揮著重要作用。本文就口腔中H2O2的來源及其在口腔微生態(tài)平衡的作用兩方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

口腔是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，過氧化氫（H2O2）是這個(gè)復(fù)雜生態(tài)系中一種重要的非特異性抗菌物質(zhì)。H2O2可由乳桿菌和牙菌斑早期定植的鏈球菌產(chǎn)生，也可來源于宿主，在調(diào)控微生態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用。H2O2可通過抑制對其敏感的微生物參與微生物間的競爭拮抗，使得對H2O2較為耐受的細(xì)菌獲得競爭優(yōu)勢，從而在生物膜形成過程中，特別是在生物膜形成初期發(fā)揮重要的菌群調(diào)節(jié)作用。H2O2可通過介導(dǎo)細(xì)胞外DNA（extracellular DNA，eDNA）的釋放，參與細(xì)菌間基因的水平轉(zhuǎn)移[1]，影響生物膜對口腔復(fù)雜環(huán)境的適應(yīng)能力；口腔內(nèi)微生物也可通過一系列耐受機(jī)制減少H2O2對自身的傷害[2-3]。此外，H2O2在微生物和宿主的交互關(guān)系中也發(fā)揮著重要作用[4-5]。本文就口腔中H2O2的來源及其在口腔微生態(tài)中的作用進(jìn)行綜述。

1  口腔中H2O2的來源

口腔中的H2O2主要來源于細(xì)菌和宿主[6]。乳桿菌和口腔鏈球菌很早就被發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)生H2O2[7-8]。定性和定量研究[9-12]發(fā)現(xiàn)，口腔鏈球菌、緩癥鏈球菌、表兄鏈球菌、血鏈球菌、戈登鏈球菌、寡發(fā)酵鏈球菌、副血鏈球菌等均能產(chǎn)生H2O2。這些鏈球菌均可以從人口腔牙菌斑中分離，且在牙菌斑中具有較高豐度[13]。體外實(shí)驗(yàn)[8-9,11]表明，細(xì)菌H2O2的產(chǎn)生與其培養(yǎng)環(huán)境條件密切相關(guān)?？谇患?xì)菌主要依賴丙酮酸氧化酶[14]、乳酸氧化酶[15]、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）氧化酶[16]和L-氨基酸氧化酶[17]等途徑來產(chǎn)H2O2。

1.1  丙酮酸氧化酶途徑

血鏈球菌和戈登鏈球菌依賴丙酮酸氧化酶產(chǎn)生H2O2，該酶由spxB基因編碼，可催化丙酮酸鹽、無機(jī)磷酸鹽和氧分子生成H2O2[14,18]。研究者通過構(gòu)建血鏈球菌和戈登鏈球菌的spxB基因的突變株和spxB基因的補(bǔ)償菌株，并比較了野生株、spxB基因突變株及spxB基因補(bǔ)償株與變異鏈球菌的競爭關(guān)系，證實(shí)spxB基因編碼丙酮酸氧化酶合成H2O2是血鏈球菌和戈登鏈球菌與變異鏈球菌細(xì)菌間相互競爭的重要分子機(jī)制[14]。

血鏈球菌和戈登鏈球菌H2O2的產(chǎn)生受細(xì)菌生長環(huán)境影響和自身相關(guān)基因的調(diào)控。Barnard等[11]系統(tǒng)研究了外環(huán)境因素對戈登鏈球菌H2O2產(chǎn)生的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中葡萄糖和蔗糖、金屬離子、pH、細(xì)菌生長期和氧分壓均會對戈登鏈球菌H2O2合成造成顯著影響。當(dāng)培養(yǎng)基中蔗糖、葡萄糖含量有限時(shí)（0.1 mmol·L-1左右），戈登鏈球菌產(chǎn)生H2O2和乳酸的能力相當(dāng)，而當(dāng)培養(yǎng)基中蔗糖和葡萄糖較為富足時(shí)，H2O2合成顯著減少。由于口腔中的各種碳源代謝底物有限，戈登鏈球菌為了獲取有限的生存空間和營養(yǎng)，可能通過產(chǎn)生H2O2來抑制其他H2O2敏感菌的生長，進(jìn)而在生物膜群落中獲得生長優(yōu)勢。Zheng等[19]發(fā)現(xiàn)，戈登鏈球菌中的分解代謝物控制蛋白CcpA可結(jié)合到spxB的啟動子，抑制spxB基因表達(dá)，從而調(diào)控戈登鏈球菌H2O2的合成。

血鏈球菌H2O2的合成也受到一系列基因的調(diào)控。Zheng等[20]研究發(fā)現(xiàn)，血鏈球菌分解代謝物控制蛋白CcpA同樣能調(diào)控spxB的表達(dá)，血鏈球菌ccpA突變株spxB表達(dá)量較野生株上調(diào)約6倍，提示血鏈球菌CcpA也可通過抑制spxB基因的表達(dá)調(diào)控H2O2的產(chǎn)生。與戈登鏈球菌不同的是，血鏈球菌spxB的表達(dá)受培養(yǎng)基中葡萄糖含量的影響并不顯著，推測血鏈球菌CcpA蛋白依賴抑制作用受到其他代謝物（例如輔脫氫酶Ⅱ）的控制。Chen等[21]通過突變血鏈球菌全局性調(diào)控因子編碼基因spxA1和spxA2，研究了這兩個(gè)基因?qū)ρ溓蚓鶫2O2產(chǎn)生的影響。研究發(fā)現(xiàn)，spxA1突變株H2O2產(chǎn)量顯著減少，spxA1補(bǔ)償株H2O2的產(chǎn)生約為野生株的80%，但spxA2突變株H2O2的產(chǎn)量與野生株相比無明顯差異，提示血鏈球菌的全局性調(diào)控因子SpxA1參與控制spxB的表達(dá)，而spxA2對該細(xì)菌H2O2的產(chǎn)生無明顯影響。Chen等[22]另一研究表明，血鏈球菌ackA、spxR和tpk三個(gè)基因的突變株與野生株相比，產(chǎn)H2O2明顯減少。ackA和spxR的突變株中spxB的表達(dá)量減少而tpk的突變株中spxB的表達(dá)量增多，推測ackA和spxR可能為spxB表達(dá)的正調(diào)節(jié)基因，而tpk為spxB表達(dá)的輔因子。Zhu等[23]設(shè)計(jì)spxB通用引物對口腔菌斑spxB的動態(tài)表達(dá)進(jìn)行定量檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，個(gè)體菌斑中spxB的表達(dá)量隨時(shí)間的改變相對穩(wěn)定，提示spxB在口腔菌斑中具有功能性作用。

1.2  乳酸氧化酶途徑

寡發(fā)酵鏈球菌除可通過丙酮酸氧化酶合成H2O2外[15]，還可通過乳酸氧化酶參與H2O2的合成。Tong等[10]發(fā)現(xiàn)，寡發(fā)酵鏈球菌可通過乳酸氧化酶利用變異鏈球菌產(chǎn)生的乳酸合成H2O2。在細(xì)菌生長的不同周期，主要負(fù)責(zé)合成H2O2的基因不同。丙酮酸氧化酶主要負(fù)責(zé)細(xì)菌生長潛伏期和對數(shù)期H2O2的產(chǎn)生，而乳酸氧化酶主要負(fù)責(zé)細(xì)菌生長平臺期H2O2的合成。

1.3  NADH氧化酶和L-氨基酸氧化酶途徑

Higuchi等[16]在變異鏈球菌耐氧菌株NCIB11723中分離純化獲得了可產(chǎn)生H2O2的NADH氧化酶Nox-1。該酶由4個(gè)相對分子質(zhì)量約為5.6×104的亞基組成，黃素腺嘌呤二核苷酸可促進(jìn)該酶H2O2合成活性。Tong等[17]發(fā)現(xiàn)，寡發(fā)酵鏈球菌乳酸氧化酶Lox突變株在蛋白胨富集時(shí)對變異鏈球菌仍具有顯著抑制作用。進(jìn)一步體外研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸氧化酶LAAO可通過7種氨基酸產(chǎn)生H2O2，該蛋白編碼基因aaoSo突變株在上述氨基酸存在條件下也不產(chǎn)生H2O2，證實(shí)寡發(fā)酵鏈球菌還可通過氨基酸氧化酶LAAO合成H2O2。

1.4  宿主來源的H2O2

H2O2是活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）的一種[24]。宿主來源的H2O2可來自眾多途徑。線粒體可通過呼吸作用產(chǎn)生ROS，包括H2O2[25-27]。細(xì)胞內(nèi)的清除系統(tǒng)有效地保護(hù)宿主免受ROS造成的傷害，其中產(chǎn)生的H2O2可能不會離開黏膜細(xì)胞，但這個(gè)途徑產(chǎn)生的H2O2的量大到足以在口腔微生態(tài)中發(fā)揮作用[5]。H2O2產(chǎn)生的另一個(gè)途徑來自巨噬細(xì)胞的氧化爆發(fā)。ROS的穩(wěn)定產(chǎn)生（包括H2O2）是巨噬細(xì)胞氧化爆發(fā)的一部分，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的ROS是針對巨噬細(xì)胞外對宿主有侵害的病原菌，因此可以自由擴(kuò)散到病原菌的附近[28]。但有研究[29-30]表明，個(gè)體巨噬細(xì)胞的含量處于一個(gè)逐日變化的過程，因此由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的H2O2量很難確定。Geiszt等[31]發(fā)現(xiàn)了另一種宿主產(chǎn)H2O2的途徑，他們發(fā)現(xiàn)表達(dá)雙氧化酶2的唾液腺細(xì)胞能持續(xù)地給唾液供應(yīng)H2O2，并且產(chǎn)生的H2O2能直接隨著唾液進(jìn)入到口腔中，這可能是唾液中H2O2的宿主來源的最主要途徑。

2  H2O2在口腔中的生物學(xué)作用

2.1  H2O2對生物膜的調(diào)節(jié)作用

H2O2可在牙菌斑生物膜形成初期影響微生物的早期定植。細(xì)菌的初始黏附在生物膜形成過程中具有重要作用。在初始黏附時(shí)，鏈球菌是主要的早期定植菌，通過特異性表面蛋白與唾液中蛋白結(jié)合，黏附定植于牙齒表面[32]。鏈球菌本身的表面蛋白也為其他口腔細(xì)菌提供了黏附和聚集的位點(diǎn)[33]。因此，初始黏附的細(xì)菌（主要是鏈球菌）為生物膜的成熟奠定了基礎(chǔ)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，血鏈球菌與低齲風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[34-35]；寡發(fā)酵鏈球菌與齲病發(fā)生呈負(fù)相關(guān)[36]，提示在生物膜形成初期，早期黏附的鏈球菌可通過產(chǎn)生H2O2抑制齲病的機(jī)會致病菌（如變異鏈球菌）的生長和定植，對早期生物膜健康發(fā)展具有重要意義。

H2O2可通過對微生物的殺傷作用在生物膜形成過程中調(diào)節(jié)生物膜的組成。在生物膜形成過程中，細(xì)菌間的距離是一個(gè)重要因素[37]。Liu等[38]通過測量距戈登鏈球菌生物膜不同距離H2O2的濃度發(fā)現(xiàn)，在距生物膜表面100 μm處H2O2濃度為1.4 mmol·L-1，而在距離生物膜表面200 μm處H2O2的濃度為0.4 mmol·L-1。1.4 mmol·L-1是一個(gè)可以抑制H2O2敏感細(xì)菌的濃度，提示細(xì)菌產(chǎn)生的H2O2主要作用于那些與其相距較近的細(xì)菌。生物膜形成過程中H2O2濃度梯度的存在提示H2O2可通過對不同H2O2敏感性的微生物進(jìn)行篩選，調(diào)節(jié)生物膜的組成。H2O2可穿過細(xì)菌細(xì)胞膜，對細(xì)菌的殺傷作用機(jī)制包括破壞細(xì)菌的酶活性或直接氧化細(xì)菌大分子（蛋白質(zhì)和DNA）[39]。H2O2的氧自由基可與Fe2+發(fā)生反應(yīng)，破壞對酶活性進(jìn)行調(diào)控的鐵硫簇[4Fe-4S]結(jié)構(gòu)[40]。此外，細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)H2O2的積累會導(dǎo)致在精氨酸、賴氨酸、脯氨酸及蘇氨酸殘基的側(cè)鏈中引入羰基引起不可逆的蛋白質(zhì)羰基化，介導(dǎo)蛋白質(zhì)的靶向降解[41-43]。

口腔細(xì)菌可以通過產(chǎn)生H2O2影響細(xì)菌eDNA的釋放和細(xì)菌感受態(tài)的形成，從而影響基因的水平轉(zhuǎn)移，進(jìn)而調(diào)節(jié)生物膜對口腔多變環(huán)境的適應(yīng)能力?？谇患?xì)菌為適應(yīng)多變的口腔環(huán)境進(jìn)化出了一系列的應(yīng)對措施，包括基因的水平轉(zhuǎn)移[1,44-45]。接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化是微生物基因水平轉(zhuǎn)移的3種形式[46]。轉(zhuǎn)化是處于感受態(tài)的細(xì)菌獲取eDNA進(jìn)行DNA同源交換的過程[47]。通過同源交換，細(xì)菌可以獲取新的基因適應(yīng)環(huán)境（如抗性基因、代謝相關(guān)基因等），同時(shí)也可修復(fù)突變的基因以維持其遺傳穩(wěn)定性[48]。細(xì)菌eDNA的釋放依賴胞外細(xì)菌素、胞壁酸水解酶、胞內(nèi)細(xì)菌素和H2O2等途徑[49]。Kreth等[14]發(fā)現(xiàn)，戈登鏈球菌和血鏈球菌染色體DNA的釋放與H2O2產(chǎn)生密切相關(guān)，SpxB缺陷株H2O2產(chǎn)生減少，染色體DNA的釋放也相應(yīng)減少。Itzek等[50]研究發(fā)現(xiàn)，戈登鏈球菌在厭氧環(huán)境下H2O2合成降低，其染色體DNA的釋放也減少；在厭氧條件下加入H2O2會導(dǎo)致DNA的釋放增加。盡管H2O2導(dǎo)致細(xì)菌DNA釋放的具體機(jī)制尚不清楚，但該研究指出H2O2并不是通過介導(dǎo)細(xì)菌裂解進(jìn)而促使DNA的釋放。細(xì)菌H2O2的產(chǎn)生也伴隨著細(xì)菌感受態(tài)的產(chǎn)生[50-51]，可以推測細(xì)菌在感知到H2O2所介導(dǎo)的DNA損傷后，可通過一些未知的分子機(jī)制釋放DNA并形成感受態(tài)細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)化修復(fù)基因損傷與突變。

口腔微生物能通過一系列機(jī)制減少H2O2的損害。部分口腔細(xì)菌能利用過氧化氫酶減少H2O2對其的傷害。“戈登鏈球菌和內(nèi)氏放線菌”是口腔細(xì)菌相互作用的經(jīng)典研究模型，戈登鏈球菌可產(chǎn)生H2O2抑制內(nèi)氏放線菌[52-53]。值得注意的是，戈登鏈球菌不能產(chǎn)生過氧化氫酶緩解H2O2對自身的傷害。Jakubovics等[3,53]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)氏放線菌可通過自身過氧化氫酶不斷消耗H2O2，從而減少H2O2對自身和戈登鏈球菌的傷害。另有研究表明，口腔細(xì)菌中的很多基因與耐受H2O2密切相關(guān)。“血鏈球菌和變異鏈球菌”以及“戈登鏈球菌和變異鏈球菌”是經(jīng)典的口腔相互競爭研究模型，血鏈球菌和戈登鏈球菌主要產(chǎn)生H2O2抑制變異鏈球菌，而變異鏈球菌可產(chǎn)生變鏈素抑制血鏈球菌和戈登鏈球菌[14,54-55]。Xu等[2]分別觀察了血鏈球菌和戈登鏈球菌dps、trxB和sodA三個(gè)基因突變株對H2O2的耐受情況，發(fā)現(xiàn)血鏈球菌和戈登鏈球菌Dps突變株對H2O2極為敏感；血鏈球菌的TrxB的突變株和戈登鏈球菌SodA突變株對H2O2的敏感也顯著增加；而血鏈球菌SodA和戈登鏈球菌TrxB突變株對H2O2的耐受無明顯變化，提示戈登鏈球菌Dps和SodA及血鏈球菌Dsp和TrxB在相關(guān)細(xì)菌耐受H2O2過程中發(fā)揮了重要作用。另外，該研究還發(fā)現(xiàn)戈登鏈球菌比血鏈球菌更耐受H2O2，推測戈登鏈球菌在牙菌斑中的豐度較低，因此需要更強(qiáng)的耐受力進(jìn)而在牙菌斑中獲得生長優(yōu)勢。Zheng等[56]發(fā)現(xiàn)，與野生株相比，變異鏈球菌谷胱甘肽合成酶基因缺失株對H2O2更敏感；進(jìn)一步通過血鏈球菌和變異鏈球菌雙菌種實(shí)驗(yàn)證明谷胱甘肽合成酶在變異鏈球菌耐受H2O2過程中有重要作用。此外，產(chǎn)H2O2細(xì)菌為了減少H2O2對自身的傷害，可通過Mn2+代替[4Fe-4S]結(jié)構(gòu)中的Fe2+，減少細(xì)胞內(nèi)依賴鐵硫簇調(diào)控活性的蛋白質(zhì)[57-58]。

2.2  H2O2在微生物與宿主交互關(guān)系中的作用

H2O2參與了微生物與宿主之間的交互作用?？谇晃⑸锱c宿主口腔細(xì)胞相互接近，微生物與宿主間存在頻繁的交互作用。微生物可產(chǎn)生對宿主有毒害作用的H2O2，對宿主造成損害。Ramsey等[59]發(fā)現(xiàn)，戈登鏈球菌產(chǎn)生的H2O2誘導(dǎo)伴放線菌嗜血菌表達(dá)基因katA和apiA，促使伴放線菌嗜血菌逃脫宿主的免疫系統(tǒng)。Okahashi等[60]發(fā)現(xiàn)，血鏈球菌可產(chǎn)生H2O2導(dǎo)致人類巨噬細(xì)胞死亡，抑制血鏈球菌ROS的產(chǎn)生可有效減少血鏈球菌對巨噬細(xì)胞的毒害作用。Okahashi等[61]進(jìn)一步研究了口腔鏈球菌SpxB對人類巨噬細(xì)胞的作用，闡明了口腔鏈球菌產(chǎn)生H2O2導(dǎo)致人類巨噬細(xì)胞死亡的機(jī)制。Okahashi等[4]還發(fā)現(xiàn)，口腔鏈球菌產(chǎn)生的H2O2可誘導(dǎo)宿主上皮細(xì)胞白細(xì)胞介素-6的表達(dá)，引起上皮細(xì)胞死亡。宿主細(xì)胞也能通過合成H2O2，起到殺菌或化學(xué)屏障的作用[28,62]。例如巨噬細(xì)胞針對病原菌的氧化爆發(fā)過程產(chǎn)生大量的ROS（包括H2O2），可殺滅病原菌或?qū)⒉≡帘卧谟蒆2O2組成的化學(xué)屏障外，進(jìn)而保護(hù)宿主。有意思的是，細(xì)菌還可以通過產(chǎn)生H2O2減少條件致病菌對宿主的侵害，乳桿菌可以通過產(chǎn)生H2O2抑制白假絲酵母菌對上皮細(xì)胞的黏附[63]。

在口腔中，生物膜中的微生物持續(xù)處于“戰(zhàn)爭與和平”的狀態(tài)，致病菌與宿主之間也時(shí)刻展開著“斗爭”。微生物可通過一系列途徑產(chǎn)生H2O2，限制有限生存資源內(nèi)的競爭對手，并采取措施減少H2O2對自身的損害。H2O2是研究產(chǎn)H2O2菌株與對H2O2敏感菌間交互關(guān)系的良好切入口。H2O2在微生物與宿主間的關(guān)系中也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。系統(tǒng)研究H2O2在口腔微生態(tài)中的作用，揭示H2O2在維持口腔微生態(tài)平衡中的更多功能，有利于更好地理解口腔微生態(tài)系統(tǒng)。

[參考文獻(xiàn)]（略）

詳見《華西口腔醫(yī)學(xué)雜志》2017年4月第35卷第2期