作者：唐成芳1  阮建平2  朱勇1  李子夏1  左艷萍1  徐紅艷3

作者單位：1.西安醫(yī)學院口腔醫(yī)學系，西安 710021；2.西安交通大學口腔醫(yī)院預防科，西安 710004；3.陜西省人民醫(yī)院口腔科，西安 710076

[摘要]  目的  評價馬尾松松針提取物（PMNE）抑制根面牙本質脫礦的效果。方法  將根面牙本質塊根據pH循環(huán)中所用實驗溶液隨機分為去離子蒸餾水（DDW）組，氟化鈉（NaF）組，4%、8%和12%PMNE組，試件進行為期8d的pH循環(huán)。顯微CT選區(qū)測定各組未脫礦牙本質和脫礦牙本質的牙本質礦物密度（DMD）及兩者DMD差值（ΔDMD），掃描電鏡下觀察pH循環(huán)后牙本質表面形貌。結果  PMNE各組和NaF組ΔDMD均顯著低于DDW組（P<0.05），且8%pmne組和12%pmne組δdmd組間差異無統計學意義（p>0.05），均顯著低于4%PMNE組，高于NaF組（P<0.05）。掃描電鏡見PMNE組牙本質小管不全暴露，小管開口程度明顯小于DDW組，大于NaF組。結論  PMNE可抑制根面牙本質脫礦，減緩酸對DMD的降低，具有一定的抗齲活性。8%PMNE即可達到較好抑制脫礦的效果。

[關鍵詞]  馬尾松松針提取物； 根面齲； 牙本質； 脫礦； 礦物密度

根面齲是發(fā)生在牙頸部涉及牙骨質、牙本質的特殊齲壞。老年人因牙齦退縮以及牙頸部薄弱部位暴露，更易發(fā)生根面齲[1-2]。據第3次全國口腔健康流行病學調查報告，全國65~74歲老年人患齲率為98.4%，根齲患病率為63.6%，根面齲是老年人牙齒缺失的主要因素之一，嚴重危害著老年人的口腔健康[1,3]。因而，采用合理、安全有效的措施防治根面齲的發(fā)生和發(fā)展是非常必要的。研究[4-5]證實齲病的發(fā)生發(fā)展是牙體組織在細菌產酸作用下，發(fā)生的礦物質溶出和有機物的崩解。因而，控制菌斑，增強礦物牙體組織抵抗酸/耐脫礦能力，促進脫礦組織再礦化被認為是“應用微創(chuàng)理念”防治老年齲進展的重要措施[5-6]。

松針，又稱松葉松毛，是松科松屬植物的葉，性溫味苦，自古記載其具有補益人體、祛風止痛、活血化淤、固齒駐顏等功效。研究證實松針提取物有抑菌/抗菌、抗衰老、抗腫瘤等多種生物學活性[7-9]，也被用于牙膏的研制[10]。本實驗采用顯微CT（micro computer tomography, Micro-CT）和場發(fā)射掃描電鏡（field emission scanning electron microscopy，FESEM）分析了我國廣泛分布的馬尾松松針提取物（Pinus massoniana needle extract，PMNE）對根面牙本質抗酸/抑制脫礦能力的影響，探索PMNE抑制根面齲的潛能。

1  材料和方法

1.1  實驗材料和器械

10︰1 PMNE（西安奧賽生物技術有限公司），氟化鈉（NaF，分析純）、磷酸二氫鉀（KH2PO4，分析純）、乙酸（CH3COOH，分析純）（西安化學試劑廠），羥乙基哌嗪乙磺酸（Sigma公司，美國），抗酸指甲油（Revlon公司，美國）。

采用去離子蒸餾水（distilled deionized water，DDW）為溶劑配制如下溶液。4%、8%和12%PMNE溶液：將PMNE加入DDW中配制質量體積百分濃度為12%的澄明溶液，DDW稀釋方式配制4%和8%的PMNE溶液，備用；用DDW溶解適量NaF配制成0.1%的NaF溶液；中性緩沖液：20 mmol·L-1羥乙基哌嗪乙磺酸，1.5 mmol·L-1 KH2PO4，pH為7.0[11]；酸性緩沖液：50 mmol·L-1 CH3COOH，1.5 mmol·L-1 KH2PO4，pH為5.0[11]。

慢速切割機（UNIPOL-830，沈陽科晶有限公司），恒溫水浴箱（上海醫(yī)療器械廠），維氏顯微硬度計（HXD-1000TM，上海泰明光學儀器有限公司），FE-SEM（FESEM S-4800，Hitachi公司，日本），Micro-CT（Explore Locus SP，通用醫(yī)療公司，美國），電感耦合等離子質譜儀（熱電有限公司，美國）。

1.2  樣本制備

取頸部平坦且完整無齲壞的新近拔除第三磨牙35顆，用慢速切割機在流水降溫下去除冠方牙體組織，制備3 mm×4 mm×2 mm的根面牙體組織塊。在流水降溫下用2 000目碳化硅砂紙打磨牙體表面至牙本質層，并使牙本質表面光滑平整。按照文獻[12]的方法，用顯微硬度計挑選出牙本質表面硬度在35~50維氏硬度值之間的試件50個。在牙本質的光滑表面一端預留3 mm×2 mm大小的開窗區(qū)，其余部位均勻涂布抗酸指甲油，干透后涂布第二層。

1.3  實驗分組及pH循環(huán)

按照所用實驗溶液不同，將50個試件隨機分為5組，分別為DDW、NaF、4%PMNE、8%PMNE和12%PMNE組，每組10個試件，其中DDW組和NaF組分別作為陰性和陽性對照組。

各組試件分別于37 ℃的恒溫水浴箱中進行pH循環(huán)：2 mL4%PMNE、8%PMNE、12%PMNE溶液、DDW或0.1%NaF等實驗溶液浸泡10min，2 mL酸性緩沖液1 h，2 mL中性緩沖液緩沖5 min。每次浸泡后用DDW徹底沖洗1 min，濾紙吸去多余水分，其余時間各試件放入37 ℃中性緩沖液中，每天緩沖3次，共8d。各實驗液及中性緩沖液每日更換1次。

1.4  牙本質礦物密度（dentin mineraldensity，DMD）的測定

循環(huán)結束后DDW徹底沖洗，室溫下用3%戊二醛溶液與0.1 mol·L-1 PBS緩沖液（1︰1，pH=7.2）固定4 h，去除牙本質表面涂布的指甲油，DDW徹底沖洗。將試件置于Micro-CT中在80 kV、80 μA、14 μm層厚條件下進行掃描，三維重建。測定每個標本未脫礦側約0.996 0 mm×0.996 0 mm大小面積（圖1A中黃色區(qū)域），且自牙本質表面向內深0.220 4 mm的長方體形區(qū)域內（即0.996 0 mm×0.996 0 mm×0.220 4 mm選區(qū)，圖1B中黃色所示區(qū)域）的DMD，作為該樣本未脫礦牙本質的礦物密度（normal dentin mineral density，NDMD），每個標本測定4個區(qū)域，計算平均值。具體測定方法見圖1。

按照未脫礦側DMD同樣測定的方法，將未脫礦側分析選區(qū)框水平平移至同一牙本質塊脫礦側的對稱位置，測定同樣大小選區(qū)內的DMD，即作為pH循環(huán)后脫礦牙本質的礦物密度（demineralized dentin mineral density，DDMD），每個標本測定4個區(qū)域，求平均值。按照如下公式計算牙本質塊NDMD與DDMD的差值（ΔDMD），ΔDMD=NDMD-DDMD。

1.5  表面微觀形貌觀察

試件經Micro-CT掃描完成后即刻用DDW沖洗，自然干燥，噴金，FE-SEM電鏡觀察各組脫礦側牙本質表面微觀形貌。

1.6  PMNE中鈣、鉬和氟含量測定

取4%PMNE溶液稀釋100倍，采用電感耦合等離子體質譜儀，測PMNE中鈣、鉬和氟元素的含量，共測定5個樣。每個樣品測定3次，求平均值。

1.7  統計學分析

采用SPSS 18.0統計軟件對NDMD、DDMD及ΔDMD進行單因素方差分析，采用組間LSD兩兩比較，檢驗水準為0.05。

2  結果

2.1  DMD測量結果

各組NDMD、DDMD和ΔDMD測量結果見表1。由表1可見，各組NDMD間差異無統計學意義（P>0.05）。DDW組DDMD最低，NaF組DDMD最高，兩組間DDMD差異有統計學意義（P<0.05）；4%PMNE組DDMD明顯高于DDW組，顯著低于8%、12%PMNE組和NaF組（P<0.05）；8%pmne組和12%pmne組比較差異無統計學意義（p>0.05），均略低于NaF組，但差異無統計學意義（P>0.05）。DDW組ΔDMD最高，NaF組△DMD最低，兩組間差異有統計學意義（P<0.05）；PMNE各組ΔDMD顯著高于NaF組，顯著低于DDW（P<0.05）；8%pmne組δdmd略低于12%pmne組，但兩組間差異無統計學意義（p>0.05），兩者均顯著低于4%PMNE組（P<0.05）。

2.2  表面微觀形貌觀察結果

各組pH循環(huán)后脫礦牙本質表面微觀形貌見圖2。由圖2可見，DDW組牙本質表面牙本質小管完全暴露，小管開口呈圓形或類圓形，牙本質表面欠平整，未見明顯膠原纖維，牙本質小管壁較疏松，可見膠原纖維。NaF組牙本質表面的玷污層完整，未見牙本質小管暴露，表面僅見3~5 μm長度的狹小微裂隙。低倍鏡下各濃度PMNE組牙本質表面的玷污層完整性受到不同程度破壞，牙本質小管口部分堵塞，呈不同程度的點隙狀開口；4%PMNE組牙本質表面點隙最大，分布最密集。高倍鏡下見4%PMNE組牙本質表面牙本質小管口暴露不全，裂隙呈3~5 μm

線狀和多角形不規(guī)則開口，但牙本質小管開口程度較DDW組明顯減小；8%和12%PMNE組牙本質表面的部分牙本質小管被堵塞，部分牙本質小管口不全暴露，呈3~5 μm長的梭形/小的不規(guī)則形開口，兩組牙本質表面的點隙狀開口基本相當，點隙大小和密集程度明顯小于4%PMNE組。

2.3  PMNE中鈣、鉬和氟含量

本樣品中鈣元素含量為（12.46±0.23） μg·mg-1，鉬元素含量為（3.31±0.12） μg·mg-1。本樣品不含氟元素。

3  討論

口腔中的致病菌可利用食物產酸致使釉質、牙本質等牙體硬組織發(fā)生脫礦，繼而脫礦裸露的膠原纖維等有機基質在酶和唾液環(huán)境中降解，導致齲病發(fā)生發(fā)展[4-5]。本實驗在pH循環(huán)模式下，以NaF作為對照觀察富含黃酮類化合物的PMNE抑制根面牙本質脫礦的作用，并分析PMNE濃度效應，為預防根面齲的發(fā)生及抑制其進展提供實驗依據。此外，為避免緩沖液對實驗結果的干擾，本實驗pH循環(huán)所用的酸性和中性緩沖液均不含鈣離子。

Micro-CT是采用X線成像原理進行超高分辨率三維成像的設備，可在不破壞樣本的情況下，定量計算樣品內部任意選定區(qū)域的體積、面積、孔隙率、礦物密度等[13]。礦物密度是根據體模和標準CT值計算得到并以單位體積的羥磷灰石含量來表示的礦物質含量，可反映單位組織內礦物質的含量[14]。牙本質等牙體組織是以無機物為主的硬組織，具有X線阻射，因而Micro-CT也被用于測定牙體組織的礦物含量和齲病動態(tài)過程及療效觀察[15]。本研究采用Micro-CT定量對比分析各組根面牙本質脫礦區(qū)、正常未脫礦等大選區(qū)內礦物密度值和兩者礦物密度差，以評價PMNE抑制酸所致牙本質脫礦的效果。結果表明，NaF和PMNE均可有效抑制根面牙本質脫礦的進展。

由于能夠促進牙體組織礦化和減弱酸對牙體組織的脫礦，故氟化物干預是當前減輕齲病進展的有效措施。本實驗Micro-CT也證實NaF組牙本質脫礦區(qū)與未脫礦區(qū)的ΔDMD顯著低于DDW組，提示0.1%NaF能有效地減弱酸對根面牙本質的脫礦作用。FESEM見NaF組牙本質表面玷污層完整而DDW組玷污層完全破壞，進一步證實了氟化物提高牙本質耐脫礦或抑制脫礦的能力。研究[12]表明，氟化物在牙本質/釉質表面可與鈣離子或羥磷灰石結合形成氟化鈣或氟磷灰石，增強根面牙本質抗酸蝕脫礦能力，促進再礦化。

本實驗也證實PMNE可抑制酸所致牙本質脫礦，其機制推測主要可能與PMNE保存脫礦牙本質有機基質有關。牙本質是含有約30%有機基質的鈣化硬組織，已有研究[16]表明保留脫礦牙本質內的有機基質可為再礦化提供支架，并形成一個機械屏障從而阻止酸的擴散和礦物離子釋出。PMNE是從馬尾松葉中提取的天然物質，其主要分子結構具有多個酚羥基的原花青素、黃酮類等生物活性成分[8-9]。原花青素、五倍子等含多酚結構的物質可通過共價鍵、離子鍵、氫鍵等與蛋白質反應，增加交聯度，增強膠原基質，使非膠原蛋白凝固，抑制金屬基質蛋白酶活性，減輕脫礦牙本質的降解[8,11-12,16]。據此推測，PMNE抑制根面牙本質脫礦的可能機制是PMNE通過原花青素、黃酮類等有效成分的多酚結構與膠原基質的相互作用，增強了膠原基質的交聯，抑制其降解，從而保存了脫礦牙本質有機基質并形成屏障。該屏障可一定程度阻礙pH循環(huán)過程中的H+擴散從而減輕脫礦。另外，由于原花青素的交聯作用以及其B環(huán)上酚羥基的螯合作用[8,12]，交聯于脫礦牙本質膠原基質的原花青素還可以通過B環(huán)上酚羥基螯合因脫礦釋出的部分鈣離子，從而阻礙鈣離子釋出。因而，雖經pH循環(huán)，PMNE組牙本質玷污層未完全被酸去除，表現為牙本質小管仍部分堵塞，而陰性對照DDW組玷污層完全被去掉，牙本質小管完全暴露，且PMNE組ΔDMD顯著低于DDW組。

此外，PMNE抑制根面組織脫礦的作用可能還與PMNE中含有的鈣元素和鉬元素相關。松針提取物中還含有鈣、磷、鉬等多種元素。本研究采用質譜儀也證實本實驗所用PMNE中含有（3.31±0.12）μg·mg-1鉬元素，（12.46±0.23） μg·mg-1鈣元素。據此推測，一方面PMNE溶液中所含鈣可沉積在脫礦牙本質表面，能促進表面的殘余羥磷灰晶體生長；另一方面PMNE處理后，其內鉬元素沉積于脫礦牙體表面，還可能增加牙本質抵抗pH循環(huán)中酸的侵蝕。據報道，增加攝入鉬元素可增強牙齒的硬度和牢固度，預防齲齒，還可提高氟再礦化表層下釉質的功效。然而鉬元素是如何發(fā)揮作用的機制還有待進一步研究。

本實驗中8%PMNE組和12%PMNE組抑制牙本質脫礦效果優(yōu)于4%PMNE。結果提示，8%PMNE即可達到良好的抑制牙本質脫礦的效果。結果可能與單位體積高濃度PMNE溶液中多酚含量、鉬元素等有效成分相對較多有關，到8%濃度時PMNE即含有能與脫礦牙本質反應的最適量有效成分。然而，PMNE是混合物，其有效成分除原花青素和鉬元素外，是否還有其他抑制牙本質脫礦的成分還有待進一步研究。

來源于華西口腔醫(yī)學雜志