【述評】生物鐘基因?qū)歉慕ǖ挠绊?/h1>

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生物鐘基因?qū)歉慕ǖ挠绊?/strong>

鄧旭亮

專家介紹：鄧旭亮，男，1972年2月生，北京大學口腔醫(yī)院科研副院長，特診科主任、教授、主任醫(yī)師，博士生導師，中國生物醫(yī)用材料產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟副理事長，生物醫(yī)用材料北京實驗室副主任，中國生物醫(yī)學工程學會生物材料分會理事。2016年入選科技部中組部“萬人計劃”，獲第七屆“全國優(yōu)秀科技工作者”，獲第十一屆光華工程科技獎青年獎，2015年獲長江學者特聘教授，2014年度獲國家杰出青年科學基金資助，2013年獲選科技部中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才，2013年作為第一完成人獲教育部 “高等學?？茖W研究優(yōu)秀成果獎”技術(shù)發(fā)明二等獎，2009年入選教育部“新世紀優(yōu)秀人才”計劃。近年來作為項目負責人主持了21項科研項目，其中國家自然科學基金項目6項、國家863項目4項、科技部國際合作項目、教育部新世紀優(yōu)秀人才支持項目、衛(wèi)生部行業(yè)科研專項課題、北京市科技計劃等，并作為主要完成人和學術(shù)骨干參加了國家及省部級科研項目14項。從口腔關(guān)鍵材料的臨床應(yīng)用特點及存在的問題出發(fā)，在新型口腔樹脂基修復材料及引導組織再生支架材料的組成、結(jié)構(gòu)設(shè)計、制備和功能仿生、納米效應(yīng)發(fā)揮及組織修復機理等方面進行了長期基礎(chǔ)研究，獲得了多項重要的理論研究進展和應(yīng)用參加成果。發(fā)表論文177篇，其中SCI收錄論文65篇，其中通信作者40篇（近五年44篇，其中通訊作者27篇），總被引用743次（SCI他引677次），單篇引用最高111次，申請25項國家發(fā)明專利（其中第一發(fā)明人申請7項），授權(quán)13項，獲國藥局Ⅲ類醫(yī)療器械注冊證3個，國內(nèi)外學術(shù)特邀報告11次，其中含大會報告5次（國際2次，國內(nèi)3次），已經(jīng)指導碩士研究生25名，博士生7名。

摘要

 生物體的生理、生化和行為的周期性震蕩稱為生物節(jié)律，由生物鐘基因調(diào)控。數(shù)十種核心鐘基因中，Clock和Bmal1最早被發(fā)現(xiàn)，并且作為整個時鐘體系的起始因子。而骨再生和改建是解決當今口腔醫(yī)學重要的前沿科學問題。因此本文以鐘基因和骨改建兩者關(guān)系為題，了解生物鐘基因的基本機制，以及生物鐘基因可能對骨改建造成的影響，初步探討Clock和Bmal1基因?qū)υ偕凸歉慕ǖ恼{(diào)控機制，總結(jié)近年來生物鐘基因影響骨改建的研究進展。

1  生物鐘基因的特點

    晝夜節(jié)律是持續(xù)運行并且以大約24 h為周期的生物節(jié)律，是生物體的生理、生化和行為的周期性震蕩，是所有生物體對可預測的環(huán)境改變的一種綜合性適應(yīng)，這幾乎是所有真核生物和部分原核生物的基本特征［1］。從單細胞生物到人，從體溫的波動、激素水平的漲落、識別和記憶能力的變化等都呈晝夜節(jié)律性。而在日常生活中，最明顯的晝夜節(jié)律是睡眠-覺醒這一生理變化。有兩種機制精確地控制著睡眠和覺醒的時間：一是機體狀態(tài)平衡機制，即睡眠穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)；另一個是晝夜節(jié)律，即在24 h內(nèi)，人體的生理機制會出現(xiàn)盛衰變化，從而調(diào)節(jié)睡眠時相［2］。這兩種機制的相互協(xié)調(diào)，影響著睡眠的時間點、長度、質(zhì)量以及醒后人體的各種機能狀況，使得身體在需要時睡覺，在得到滿足后醒來［3］。

　　晝夜節(jié)律發(fā)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是分子計時器，即晝夜節(jié)律生物鐘，從哺乳動物到細菌的大多數(shù)生物體都有這樣一個計時裝置［4］。早在2002年，有研究發(fā)現(xiàn)在哺乳動物中，下丘腦的視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）是實現(xiàn)這一神經(jīng)系統(tǒng)功能的重要核團，因而被稱為中樞生物鐘［5］。中樞生物鐘可以通過眼睛的特殊光感受器來感受外界環(huán)境明暗變化，再通過視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（非視細胞或視色素）將信息通過視網(wǎng)膜下丘腦束傳遞至SCN腹外側(cè)部即“視網(wǎng)膜-下丘腦信號通路”，從而導引位于SCN的主生物鐘的節(jié)律性振蕩，使輸出節(jié)律與太陽晝夜的變化一致。它使各種生命活動（如體溫、血壓、激素分泌量、骨發(fā)育等）每天有節(jié)律并且有序的表現(xiàn)出來。

    隨著研究進展，截至2011年，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)10余個核心生物鐘基因，比如Clock、Bmal1、Pers、Cry、Tim、Tau等，這些核心生物鐘基因在細胞內(nèi)互相作用，形成一系列的轉(zhuǎn)錄/翻譯的反饋環(huán)來調(diào)控彼此的表達量，從而使這些基因在恒定的光照-黑暗周期中呈現(xiàn)節(jié)律性的表達［6-7］。基因啟動子內(nèi)的E-box序列（常規(guī)形式：CACGTG，非常規(guī)形式CACGTT等）是這些基因進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控的目標［8］。核心鐘基因按其對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用分為兩大類：Clock和Bmal1被歸為正向調(diào)控部分；Cry1、Cry2、Per1和Per2被歸為負向調(diào)控部分［9］。

　　2006年，研究發(fā)現(xiàn)生物鐘基因的分子運行機制大致是：Bmal1與Clock蛋白互為分子伴侶，二者相互結(jié)合成Bmal1/Clock異二聚體。Bmal1和Clock基因形成中心振蕩環(huán)的正向元件。Bmal1基因作為時鐘體系的起始因子，以Bmal1/Clock異二聚體的形式與靶基因啟動子的E-box元件結(jié)合，最常見的是與含有CACGTG核苷酸序列的E-Box之間有著高度親和力（也有CACGTT的非常規(guī)的表現(xiàn)形式），然后驅(qū)動3個周期基因（Per1、Per2和Per3）、2個隱花色素（Cry1和Cry2）和轉(zhuǎn)錄阻抑物REV-ERBA基因的節(jié)律轉(zhuǎn)錄，繼而Per和Cry蛋白形成復合體進入細胞核，抑制Bmal1/Clock二聚體的活性，構(gòu)成反饋的負向環(huán)路，產(chǎn)生時鐘節(jié)律［10-11］（圖1）。

圖1  生物鐘基因的分子運行機制

    隨著研究的進展，發(fā)現(xiàn)生物鐘基因的分子運行機制不僅存在于作為中樞的SCN中，在周圍組織（心臟、肝臟、腎臟、成纖維細胞和外周淋巴細胞等）也存在生物鐘基因的表達［12］，也同樣參與調(diào)解各種已分化細胞或干細胞內(nèi)獨特生命活動的晝夜節(jié)律。生物鐘基因在細胞分裂、骨形成、能量代謝、腫瘤形成等多種重要生理過程中起到重要作用。周邊組織的生物鐘受到中樞生物鐘的嚴密調(diào)控。實驗表明，在SCN破壞的情況下，周邊組織的整體生物節(jié)律也逐漸消失［13］。因此，生物鐘基因在機體的平衡調(diào)控中起到關(guān)鍵作用。

2  生物鐘基因?qū)歉慕ǖ恼{(diào)控

    骨骼系統(tǒng)是機體的主體系統(tǒng)，是一種高活性組織。骨骼系統(tǒng)的發(fā)生在胚胎早期就已經(jīng)開始，但在之后的一生中還會不斷改建和更新，以修復自身微損傷、保持骨組織結(jié)構(gòu)、行使負重等功能。研究表明，人類每年有10%的骨改建代謝重建，骨骼系統(tǒng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡就是靠骨重建來實現(xiàn)的［14］。骨形成的過程包括兩種方式：軟骨內(nèi)成骨和骨膜內(nèi)成骨。對成年期的骨骼來說，骨形成只發(fā)生在骨缺損需要重建的位置。骨改建包括骨吸收和骨形成兩個方面，涉及到覆蓋在骨骼表面的骨襯細胞皺縮、破骨細胞填補位置，并將鈣化的基質(zhì)吸收形成骨陷窩，以及成骨細胞進入骨陷窩重新充填新的骨質(zhì)［15-16］。

    近十年來，很多文獻表明了生物鐘基因與骨形成和骨改建存在著聯(lián)系。目前的研究大多還局限在小鼠模型上。生物鐘基因缺失在小鼠上不僅體現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律紊亂，同時也伴有活動減少、體重減輕、生命延長等表現(xiàn)［17］。有研究顯示，將離體小鼠軟骨細胞培養(yǎng)于三維海綿中，通過對位于骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的細胞漿、細胞骨架、細胞核中的12 000多種基因的DNA微點陣分析發(fā)現(xiàn)：生物鐘基因Clock以及Per1、Per2在軟骨中均有表達，并呈現(xiàn)典型的晝夜節(jié)律［18］。

    近些年的研究發(fā)現(xiàn)，生物鐘基因在骨細胞中也有表達，并且調(diào)控骨重建的過程。生物鐘基因Per1、Per2、Cry1、Cry2基因的敲除將會導致整個小鼠的骨體積變大，而不會造成身體組分的改變和其他明顯的代謝紊亂。Per2的功能性敲除導致雌鼠骨體積呈現(xiàn)年齡依賴性增長［19］。有研究也表明，在Per2-Brdm1突變小鼠中，骨形成速率大量提高，但是成骨細胞和破骨細胞的數(shù)量并沒有增加，可能主要是因為調(diào)節(jié)成骨細胞活性因子釋放的功能發(fā)生了改變［20］。在Cry2-/-小鼠中，成骨細胞的活性沒有明顯改變，但是破骨細胞的活性被降低，從而骨吸收的速率降低，導致這類小鼠有比較高的骨體積［21］，這與在Per2 Brdm1突變小鼠中觀察到的骨表性不同，進一步表明生物鐘基因在調(diào)控骨平衡中各自起著不同的作用。

    1997年，Ikeda和Nomura研究小組首先命名了Bmal1。Bmal1基因又名Mop3、芳烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白3（aryl-hydrocarbon receptor nuclear translocator 3，ARNT3）基因，是一種調(diào)節(jié)生物節(jié)律的重要轉(zhuǎn)錄因子，其表達產(chǎn)物Bmal1蛋白是正反饋環(huán)路的調(diào)節(jié)因子之一。Honma等［22］的進一步研究中，在人的基因組已得到的體外表達的小段序列中，發(fā)現(xiàn)了Bmal1基因是一段含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋（PAS）結(jié)構(gòu)域的基因序列，并成功的進行了克隆。

    1999年，Takahashi研究小組發(fā)布了對人類Clock（hClk）的克隆結(jié)果，得到了人類cDNA 編碼的Clock蛋白。人類Clock蛋白編碼序列為2 538 bp，其中89%與小鼠類似；hClk定位于4號染色體長臂（4q12），含20個外顯子，其內(nèi)含子、外顯子的組成也與小鼠一樣，這將是小鼠模型的實驗結(jié)果可能同樣適用于人的依據(jù)［23］。

2014年，在小鼠模型組織學水平的研究中發(fā)現(xiàn)，Clock基因敲除能夠促進骨密度的增加，同時引起骨小梁數(shù)量、厚度、骨體積比以及皮質(zhì)骨厚度的增加，骨小梁間隔變小；Bmal1基因敲除導致骨密度的減少，同時引起骨小梁數(shù)量、厚度、骨體積比以及皮質(zhì)骨厚度的減少，骨小梁間隔變大。該實驗在細胞學水平上的研究認為：Clock基因促進骨的生長和發(fā)育主要是促進成骨細胞的分化和礦化；而Bmal1基因抑制骨的形成和發(fā)育主要從抑制成骨細胞的分化和礦化以及促進破骨細胞的增殖兩個方面［24］。

近年，可查到的文獻還僅限于Clock基因和Bmal1基因?qū)歉慕ǖ挠绊懀渌诵溺娀驅(qū)歉慕ǖ挠绊戇€有待進一步研究。

3  生物鐘基因與血管生長的關(guān)系

    文獻表明，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）可以促進骨愈合及移植骨內(nèi)成骨［25］。所以，生物鐘基因可能通過影響血管內(nèi)皮生長因子表達等方式間接影響成骨。

    血管的生長發(fā)育受到多因子的調(diào)控，如血管生成素1（angiogenin-1，Ang-1）可以穩(wěn)定血管的生長［26］，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可以促使血管出芽［27］。在這些因子的相互作用下，血管會以特定的方向出芽并逐漸進行生長，并且不斷的重塑最后形成復雜而有層次的血管網(wǎng)絡(luò)。

    2012年，有研究證實脊椎動物體內(nèi)的生物鐘基因可以對血管生長發(fā)育起到作用。在斑馬魚體內(nèi)，Per2和Bmal1對依賴VEGF的血管新生中發(fā)揮相反的作用［28］。2015年，有實驗利用基因敲除的小鼠模型證實，Per1、Per2和Bmal1基因?qū)φ０l(fā)育階段的小鼠的脈管生長沒有明顯的作用。該研究認為，和斑馬魚模型產(chǎn)生差異的主要原因可能是：第一，在哺乳動物體內(nèi)Bmal1和Per2可能依然可以調(diào)控VEGF的表達，但是調(diào)控幅度不足以引起明顯血管新生的缺陷；第二，哺乳動物體內(nèi)存在更完善的代償機制，從而啟動其他信號通路平衡VEGF的表達，保證正常脈管的發(fā)育；第三，哺乳動物體內(nèi)脈管生長的調(diào)控機制與斑馬魚相比更加復雜，而這種差異需要更進一步的研究和證據(jù)去說明［29］。

4  生物鐘基因與骨改建的研究展望

    截至2016年4月24日在美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上的關(guān)聯(lián)詞查詢，可見近些年對于生物鐘基因（Clock gene）與骨改建（Bone remodeling）共同的研究還比較少（圖2）。目前生物鐘基因的研究大多是和腫瘤等疾病相關(guān)，而與調(diào)控生長發(fā)育的文獻較少。研究表明，機體內(nèi)大約30%基因受生物鐘基因調(diào)控，所以我們可以猜想，骨的改建是與生物鐘基因息息相關(guān)的。

圖2  NCBI關(guān)于生物鐘基因與骨改建的相關(guān)研究統(tǒng)計（截至2016年4月24日）

    研究表明，生物鐘大致是48 h節(jié)律的震蕩方式［30］，而骨的改建是一個長期動態(tài)的過程。我們可以猜想骨組織生長發(fā)育的節(jié)律性是受生物鐘節(jié)律的影響。但是人體長期骨組織生長研究中，標本采集是很難實現(xiàn)的，所以大多實驗都僅僅局限于細胞水平。但是對于完整人體，細胞節(jié)律性受到核心生物鐘基因的調(diào)控，單獨的體外細胞實驗難以說明其在機體中起到的作用。

    當今，骨缺損的患者在口腔修復中很常見，如果能夠探究清楚生物鐘基因?qū)歉慕ǖ恼{(diào)控，就能通過調(diào)控生物鐘基因來獲得更好的骨改建治療效果。試想，如果我們可以通過調(diào)節(jié)飲食睡眠等每天的習慣，就可以提高修復骨缺失的治療效果，那么就可以對骨量不足患者的臨床治療起到很大幫助。關(guān)于生物鐘基因?qū)歉慕ㄓ绊憴C制我們還知之甚少，但隨著研究的深入，這些結(jié)果必定會成為我們修復缺損骨組織的重要研究依據(jù)。

信息來源：口腔醫(yī)學雜志

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