細菌非編碼小RNA對細菌毒力的調(diào)控作用

作者：王祿1 鄭欣1 王詩達2 李繼遙1 徐欣1（通信作者）

作者單位：1.口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫(yī)院牙體牙髓病科（四川大學(xué)）；2.全科門診，成都 610041

[摘要] 在病原菌與宿主長期的交互作用過程中，病原菌可通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達響應(yīng)宿主微環(huán)境的變化，以適應(yīng)宿主內(nèi)環(huán)境并在宿主體內(nèi)生存。過去認為，細菌的基因表達調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。近年發(fā)現(xiàn)，細菌非編碼小RNA（sRNA）在調(diào)控細菌致病機制方面發(fā)揮著重要作用。細菌sRNA是一類長度在50~500個核苷酸之間的非編碼RNA，病原菌可感受宿主微環(huán)境的變化，通過sRNA調(diào)控自身毒力相關(guān)基因的表達，促進致病菌在宿主內(nèi)的生存能力，利于致病菌對宿主的侵襲及致病。相對于各種轉(zhuǎn)錄因子，sRNA介導(dǎo)的基因表達調(diào)控可使細菌更快速、靈敏地對外界環(huán)境變化作出應(yīng)答。目前已發(fā)現(xiàn)多種與細菌毒力及致病性相關(guān)的sRNA，可在轉(zhuǎn)錄后水平精細調(diào)節(jié)細菌毒力及其致病機制。本文就sRNA調(diào)控細菌毒力的分子機制及其在常見病原菌致病過程中的作用進行綜述。

[關(guān)鍵詞] 非編碼小RNA；轉(zhuǎn)錄后調(diào)控；細菌；毒力因子

細菌非編碼小RNA（small noncoding RNA，sRNA）是一類含有50~500個核苷酸，在基因組中被轉(zhuǎn)錄但不編碼蛋白質(zhì)的RNA[1]。在病原菌與宿主長期的交互作用過程中，病原菌可通過感應(yīng)宿主信號（如溫度、pH值、氧含量、滲透性等）調(diào)節(jié)基因的表達，以適應(yīng)宿主內(nèi)環(huán)境并在宿主內(nèi)生存[2]。傳統(tǒng)觀念認為，原核生物基因表達調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平；但近年來研究發(fā)現(xiàn)，原核生物與真核生物一樣都存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制，而這種調(diào)控與sRNA密切相關(guān)[3]。目前已在大腸埃希菌、霍亂弧菌、沙眼衣原體、單核細胞增生李斯特菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌以及產(chǎn)氣莢膜梭菌等多種細菌中發(fā)現(xiàn)了sRNA[4]。sRNA在調(diào)控細菌基因表達方面具有重要作用。相對于轉(zhuǎn)錄因子在生物體中對基因的表達調(diào)控，sRNA介導(dǎo)的基因表達調(diào)控可使細菌對外界環(huán)境變化作出更快速的應(yīng)答。當致病菌進入宿主內(nèi)感應(yīng)宿主微環(huán)境變化，可通過sRNA調(diào)整自身毒力基因的表達，促進致病菌在宿主內(nèi)的生存能力，利于致病菌對宿主的侵襲及致病[5]。目前已發(fā)現(xiàn)多種與細菌的毒力及致病性相關(guān)的sRNA，這些sRNA作為細菌毒力調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要組成部分，在轉(zhuǎn)錄后水平精細調(diào)節(jié)細菌毒力及其致病機制。本文就sRNA調(diào)控細菌毒力的分子機制及其在常見病原菌致病過程中的作用作一概述。

1 sRNA調(diào)控細菌毒力的分子機制

細菌sRNA作為一種重要的基因表達調(diào)控元件，在轉(zhuǎn)錄后層面精密調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達水平，其調(diào)控細菌毒力表達的主要分子機制可分為以下3種。

1.1 堿基互補配對機制

細菌sRNA與靶mRNA堿基互補配對結(jié)合，調(diào)節(jié)靶標mRNA的翻譯或影響其穩(wěn)定性，促進或降低mRNA的降解，這是sRNA發(fā)揮調(diào)控功能的最主要機制。

1.1.1 順式編碼的sRNA 順式編碼的sRNA通常是由其所調(diào)控靶標基因的互補鏈轉(zhuǎn)錄而來，并且能夠與其調(diào)控的靶標基因形成完全互補配對。目前順式編碼sRNA在質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子及染色體中均有發(fā)現(xiàn)，可與靶標mRNA完全互補配對調(diào)控目標基因的表達，這些基因多為毒力相關(guān)的基因[6-7]。例如枯草芽孢桿菌的抗毒素sRNA RatA與txpA mRNA堿基互補配對后，在RNase Ⅲ的協(xié)同作用下，介導(dǎo)txpA mRNA降解，進而抑制毒素TxpA的合成[8]。大腸埃希菌抗毒素sRNA RdlD通過與ldrD mRNA堿基互補配對，抑制ldrD mRNA翻譯起始或影響其穩(wěn)定性，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控毒素ldrD的表達[6]。

1.1.2 反式編碼的sRNA 反式編碼的sRNA通常由細菌染色體中與其所調(diào)控靶基因不相鄰的基因區(qū)轉(zhuǎn)錄而來[9]，通常對靶基因起負性調(diào)控作用，能夠與靶標mRNA通過不完全的堿基互補配對方式結(jié)合，這種堿基互補配對通常位于mRNA的5’-非翻譯區(qū)（5’-untranslated regions，5’-UTR），覆蓋核糖體的結(jié)合位點；或者通過促進RNase介導(dǎo)的降解作用，影響靶標基因的表達[10]。一些sRNA還可與mRNA SD/ AUG上游區(qū)域互補配對，破壞其二級結(jié)構(gòu)，暴露核糖體結(jié)合位點，激活靶標基因的表達[11]。反式編碼sRNA在轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控過程通常需要RNA伴侶蛋白Hfq的協(xié)助。Hfq促進sRNA與其靶標mRNA互補配對，保護sRNA穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)靶標基因的翻譯或穩(wěn)定性[12]。

1.2 調(diào)控蛋白質(zhì)活性

sRNA除了通過與靶標mRNA堿基互補配對來調(diào)控基因的表達以外，還可通過模仿核酸結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性，影響毒力基因的表達[13]。CsrA（RsmA）蛋白家族作為RNA結(jié)合蛋白，可以與靶標mRNA的5’-UTR區(qū)域結(jié)合，調(diào)控靶基因的翻譯或其穩(wěn)定性，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控毒力因子表達。sRNA CsrB和CsrC序列中存在多個CrsA結(jié)合位點，能夠被CrsA識別并結(jié)合，進而與CrsA的靶標mRNA競爭，使CsrA與靶標mRNA解離，抑制CsrA的調(diào)控作用，從而調(diào)控下游基因的表達。在銅綠假單胞菌中，sRNARsmY和RsmZ通過同樣的方式調(diào)控RsmA蛋白的活性[14-15]。大腸埃希菌RNA聚合酶的σ亞基可識別基因啟動子區(qū)域，啟動轉(zhuǎn)錄。6SRNA可模擬啟動子并與σ亞基結(jié)合，從而改變RNA聚合酶的活性，影響轉(zhuǎn)錄過程[16]。

1.3 行使管家功能的sRNA

除了上述sRNA之外，還有一種具有管家功能的sRNA，包括轉(zhuǎn)運信使RNA（transfer-messenger RNA，tmRNA）、M1 RNA和4.5S RNA，是細菌行使生物學(xué)功能必需的sRNA。tmRNA在蛋白質(zhì)合成過程中具有質(zhì)量控制作用，當翻譯出現(xiàn)錯誤時，tmRNA可將滯留的核糖體解脫并介導(dǎo)缺陷蛋白質(zhì)水解。tmRNA還可以在細菌基因表達以及應(yīng)對環(huán)境壓力等方面發(fā)揮重要功能[17]。M1 RNA是組成RNaseP的亞單位，RNaseP對細菌轉(zhuǎn)運RNA（transfer RNA，tRNA）前體5’末端進行剪切，促進tRNA成熟。4.5S RNA是信號識別顆粒的組成部分，參與識別核糖體上新生肽的信號序列[18]。

2 sRNA在調(diào)控細菌致病性中的作用

2.1 大腸埃希菌

大腸埃希菌是在細菌sRNA研究中使用最多的模式菌，目前已發(fā)現(xiàn)多種與其致病調(diào)控相關(guān)的sRNA。調(diào)節(jié)蛋白CsrA是Csr系統(tǒng)（碳儲存調(diào)節(jié)系統(tǒng)）的中心組件，能夠在碳饑餓、群體感應(yīng)、糖原合成、乙酸代謝、菌毛合成及細菌毒力調(diào)控等多方面發(fā)揮作用。目前發(fā)現(xiàn)CsrB及CsrC兩種sRNA能夠在細菌指數(shù)生長期拮抗CsrA活性并抑制細菌生長穩(wěn)定期的多種代謝通路[19]。另一種sRNA—RyhB在大腸埃希菌鐵代謝調(diào)控中具有重要作用。當鐵離子濃度高時，F(xiàn)e2+-Fur蛋白（鐵攝取調(diào)節(jié)子）可與ryhB基因結(jié)合，阻止RyhB轉(zhuǎn)錄。當鐵離子濃度低時，F(xiàn)ur蛋白與鐵離子解離，構(gòu)象發(fā)生改變，不能與ryhB基因結(jié)合，失去對ryhB基因的轉(zhuǎn)錄阻遏作用，RyhB進而與多種鐵結(jié)合蛋白mRNA結(jié)合，調(diào)節(jié)細菌對鐵的吸收[20]。對致病性大腸埃希菌CFT073的研究表明，RyhB還與細菌定植密切相關(guān)。在鼠尿路感染模型中，ryhB缺陷株在膀胱的定植能力顯著降低[21]。腸出血性大腸埃希菌是出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒綜合征的病原菌，其毒力因子主要由LEE毒力島基因編碼而成，包括LEE1-LEE5共5個操縱子。sRNA GlmY和GlmZ能夠干擾LEE4以及LEE5的轉(zhuǎn)錄，同時促進效應(yīng)器EspFu的翻譯，而EspFu在A/E損傷（腸出血性大腸埃希菌黏附到宿主腸道上皮細胞，與宿主細胞相互作用，介導(dǎo)宿主細胞的黏附與擦拭性損傷即A/E損傷）形成的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要功能。除了上述兩種sRNA外，腸出血性大腸埃希菌還有幾種獨特的sRNA，如Esr41可調(diào)節(jié)菌毛的表達及細菌活性，AsxR及AgvB分別參與調(diào)節(jié)血紅素加氧酶及氨基酸代謝活性[22]。

2.2 金黃色葡萄球菌

RNAⅢ是金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)的第1個與細菌致病毒力調(diào)控相關(guān)的sRNA。RNAⅢ的長度為514 nt，由14個莖環(huán)結(jié)構(gòu)折疊而成，具有雙重功能，既可作為mRNA編碼δ-溶血素，又能作為調(diào)控因子調(diào)控多個毒力相關(guān)基因的表達。RNAⅢ5’端與呈折疊狀態(tài)的hla mRNA二級結(jié)構(gòu)結(jié)合時，暴露出核糖體結(jié)合位點，激活α-溶血素的表達[2,23-24]。RNAⅢ3’端包含3個冗余的富含C序列的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，能與靶mRNA的核糖體結(jié)合位點的G序列結(jié)合，以阻止核糖體就位，并與RNaseⅢ共同作用誘導(dǎo)靶mRNA快速降解。這些靶mRNA包括spa、coa、SA1000及rot mRNA。spa mRNA及coa mRNA分別編碼蛋白A及凝固酶。蛋白A是該菌表面的主要黏附素，SA1000 mRNA編碼黏附素樣蛋白因子，在金黃色葡萄球菌黏附和侵染表皮細胞時發(fā)揮重要功能。rot mRNA編碼毒素轉(zhuǎn)錄抑制物Rot，通過抑制Rot的合成，RNAⅢ可調(diào)控下游毒力基因的表達，間接激活許多外毒素的轉(zhuǎn)錄?？梢奟NAⅢ能夠在轉(zhuǎn)錄后水平與靶mRNA直接結(jié)合，抑制細胞表面黏附素的合成；而在轉(zhuǎn)錄水平上，通過抑制Rot的合成間接激活外毒素表達[24-26]。

2.3 單核細胞增生李斯特菌

在單核細胞增生李斯特菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種與毒力表達調(diào)控相關(guān)的sRNA。sRNA LhrA通過與chiA mRNA堿基互補配對，干擾核糖體就位，抑制其轉(zhuǎn)錄，在轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)控chiA（編碼殼質(zhì)酶）的表達[27]。ChiA是單核細胞增生李斯特菌致病相關(guān)的重要毒力因子，可通過抑制宿主的先天免疫應(yīng)答來提高細菌的毒力[28]。LhrA對ChiA的調(diào)控作用依賴于毒力調(diào)節(jié)因子PrfA和σB的參與。LhrC是該菌中另一個與毒力調(diào)控相關(guān)的sRNA，可通過與lapB mRNA互補配對負性調(diào)控LapB的表達。LapB是一種與細菌致病毒力相關(guān)的胞壁蛋白。在血液中，LhrC高表達抑制lapB的表達，可使細菌逃避宿主的免疫系統(tǒng)[29]。研究[30]發(fā)現(xiàn)，Rli31、Rli33-1和Rli50 sRNA與單核細胞增生李斯特菌的致病毒力相關(guān)，這3株sRNA缺失株在小鼠和昆蟲感染模型中的毒力均顯著下降。

2.4 產(chǎn)氣莢膜梭菌

產(chǎn)氣莢膜梭菌中的sRNA VR-RNA（VirR調(diào)節(jié)RNA）是VirR/VirS 雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)的二級RNA調(diào)節(jié)子，能夠調(diào)控（正性或負性）多種毒力因子的表達。VirR/VirS-VR調(diào)控級聯(lián)可以正調(diào)控多種毒力相關(guān)基因，包括plc（編碼α-毒素）、colA（編碼κ-毒素）、nagL（編碼透明質(zhì)酸酶），nanI及nanJ（編碼唾液酸酶）；還可以調(diào)控多種毒力相關(guān)操縱子的表達，對nanE-nanA操縱子有正調(diào)控作用，對與莢膜多糖合成相關(guān)的操縱子（CPE0474-CPE0490、CPE0491-CPE0497、CPE0500-CPE0502）則呈負性調(diào)節(jié)[31-32]。VirX是產(chǎn)氣莢膜梭菌中第2個與毒力因子調(diào)控相關(guān)的sRNA，能夠調(diào)控毒力基因pfoA（編碼θ-毒素）、plc及colA的表達[33]。

2.5 銅綠假單胞菌

GacS-GacA-RsmY-Z-RsmA傳導(dǎo)通路在調(diào)控銅綠假單胞菌的致病毒力方面具有重要作用[23]。GacSGacA雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)可正性調(diào)節(jié)sRNA RsmY和RsmZ的表達。RsmA是一種RNA結(jié)合蛋白，sRNA RsmY/ RsmZ能夠與其結(jié)合，解除RsmA與靶標mRNA的結(jié)合，促進靶標mRNA的翻譯。RsmA作為一種翻譯調(diào)節(jié)蛋白，能夠調(diào)控多種毒力相關(guān)基因的表達，包括與綠膿菌素、氰化氫及PA-IL凝集素合成相關(guān)的基因[34-36]。此外，RsmA在銅綠假單胞菌致急性感染向慢性感染轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮重要作用。RsmA可上調(diào)銅綠假單胞菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)和Ⅳ型菌毛的合成及鞭毛的活力，抑制Ⅵ型分泌系統(tǒng)及生物膜的形成能力[14,37]。氮源調(diào)節(jié)的sRNA NrsZ能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)rhlA（合成鼠李糖）基因的表達，進而調(diào)控銅綠假單胞菌的群集運動，影響其活力[38]。

2.6 沙眼衣原體

沙眼衣原體是一種專性細胞內(nèi)寄生的原核微生物，具有獨特的細胞內(nèi)二相生活周期，即有感染性而沒有代謝活性的原體和只有代謝活性而沒有感染性的網(wǎng)狀體，這兩種形式的相互分化由在分化周期后期表達的組蛋白樣蛋白HctA所調(diào)控。HctA伴隨著網(wǎng)狀體向原體分化過程而表達，通過調(diào)整DNA拓撲結(jié)構(gòu)或與DNA或RNA結(jié)合來抑制轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。sRNA IhtA通過與hctA mRNA結(jié)合調(diào)控HctA的表達。當沙眼衣原體入侵宿主細胞后，由原體形式分化為網(wǎng)狀體形式，IhtA表達上升，HctA蛋白合成水平下降；當由網(wǎng)狀體形式向原體分化時，IhtA轉(zhuǎn)錄水平下降，而HctA蛋白的表達上升[39-40]。

2.7 化膿性鏈球菌

化膿性鏈球菌是一種機會致病菌，可產(chǎn)生多種毒力因子，包括毒素和侵襲性酶等。這些毒力因子可由多種調(diào)控機制所調(diào)控，其中sRNA有重要作用。在化膿性鏈球菌中，有3種主要的sRNA參與其毒力因子的調(diào)控過程。sRNA Fasx是fasBCAX操縱子的一員，該操縱子編碼兩種組氨酸鏈激酶（FasB和FasC）和一種反應(yīng)調(diào)節(jié)因子（FasA）。sRNA FasX可在轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)化膿性鏈球菌表面的菌毛合成能力，降低其對宿主細胞的黏附能力，同時上調(diào)外分泌毒力因子鏈激酶的表達。在感染過程中，F(xiàn)asX可促進細菌由定植階段向擴散階段進展[41-42]。Klenk等[43]研究表明，F(xiàn)asx能夠通過影響細菌黏附、細胞因子基因的轉(zhuǎn)錄及釋放、宿主細胞的凋亡來調(diào)控化膿性鏈球菌與喉上皮細胞的相互作用。sRNA Pel類似于金黃色葡萄球菌中sRNA RNAⅢ，具有雙重功能，既能編碼蛋白質(zhì)，又對多種毒力因子具有調(diào)控作用。sRNA Pel能夠在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因emm（編碼M蛋白）、nga（編碼NAD-糖水解酶）和sic（編碼鏈球菌補體系統(tǒng)抑制劑），同時在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因speB（編碼半胱氨酸蛋白酶SpeB）[44]。sRNA RivX能夠與調(diào)節(jié)蛋白RivR協(xié)同作用正性調(diào)控毒力相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，包括基因emm、sic、speB、scpA（C5a肽酶）、fba（纖連蛋白結(jié)合蛋白）、scl（膠原蛋白樣蛋白）及mga（轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Mga）。上述基因直接或間接被轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Mga所激活[45]。

3 口腔細菌中的sRNA

近年來，運用高通量RNA-seq測序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測，在口腔相關(guān)致病菌中發(fā)現(xiàn)了大量sRNA，但僅有極少數(shù)sRNA的功能被闡明。變異鏈球菌是口腔生物膜中常見的致齲菌，已發(fā)現(xiàn)有多個sRNA[46-48]，但其在轉(zhuǎn)錄后層面調(diào)節(jié)靶基因的表達機制尚不清楚。Koyanagi等研究[49]發(fā)現(xiàn)，反義sRNA在染色體的毒素-抗毒素（toxin-antitoxin，TA）系統(tǒng)中具有重要調(diào)節(jié)作用。變異鏈球菌存在由Fst樣毒素（Fst-Sm）及順式編碼sRNA（srSm）組成的Ⅰ型TA系統(tǒng)（Fst-Sm/srSm），順式編碼的sRNA可通過與毒素mRNA的核糖體結(jié)合位點結(jié)合調(diào)控毒素的表達。變異鏈球菌細菌毒素的過表達可被共表達的sRNA抗毒素中和。通過基因工程手段過表達變異鏈球菌Fst-Sm/srSm系統(tǒng)可減少群落內(nèi)耐受細胞壁合成抑制劑的細菌數(shù)量[49]。在牙齦卟啉單胞菌中也已發(fā)現(xiàn)多種sRNA[50-51]。Amarasinghe等[52]在伴放線菌聚集桿菌中發(fā)現(xiàn)4種受鐵離子及轉(zhuǎn)錄因子Fur調(diào)控的sRNA，其中sRNA JA03過表達會引起細菌生物膜形成能力的下降。

盡管目前已發(fā)現(xiàn)上百種細菌sRNA，但僅有小部分sRNA的生物學(xué)功能得以闡釋。進一步鑒定細菌sRNA的靶基因，闡明sRNA的激活途徑、交互作用網(wǎng)絡(luò)及其對靶基因的作用模式與機制將有助于全面深入理解細菌sRNA在轉(zhuǎn)錄后層面精細調(diào)控細菌生理功能的能力。隨著高通量實施測序技術(shù)的發(fā)展，sRNA的調(diào)控機制及網(wǎng)絡(luò)會得以更加深入地研究，有望為細菌毒力控制及細菌相關(guān)性感染性疾病的控制提供新的思路與模式。

來源：《華西口腔醫(yī)學(xué)雜志》2016年8月第34卷第4期

作者：王祿1 鄭欣1 王詩達2 李繼遙1 徐欣1（通信作者）

作者單位：1.口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫(yī)院牙體牙髓病科（四川大學(xué)）；2.全科門診，成都 610041

[摘要] 在病原菌與宿主長期的交互作用過程中，病原菌可通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達響應(yīng)宿主微環(huán)境的變化，以適應(yīng)宿主內(nèi)環(huán)境并在宿主體內(nèi)生存。過去認為，細菌的基因表達調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。近年發(fā)現(xiàn)，細菌非編碼小RNA（sRNA）在調(diào)控細菌致病機制方面發(fā)揮著重要作用。細菌sRNA是一類長度在50~500個核苷酸之間的非編碼RNA，病原菌可感受宿主微環(huán)境的變化，通過sRNA調(diào)控自身毒力相關(guān)基因的表達，促進致病菌在宿主內(nèi)的生存能力，利于致病菌對宿主的侵襲及致病。相對于各種轉(zhuǎn)錄因子，sRNA介導(dǎo)的基因表達調(diào)控可使細菌更快速、靈敏地對外界環(huán)境變化作出應(yīng)答。目前已發(fā)現(xiàn)多種與細菌毒力及致病性相關(guān)的sRNA，可在轉(zhuǎn)錄后水平精細調(diào)節(jié)細菌毒力及其致病機制。本文就sRNA調(diào)控細菌毒力的分子機制及其在常見病原菌致病過程中的作用進行綜述。

[關(guān)鍵詞] 非編碼小RNA；轉(zhuǎn)錄后調(diào)控；細菌；毒力因子

細菌非編碼小RNA（small noncoding RNA，sRNA）是一類含有50~500個核苷酸，在基因組中被轉(zhuǎn)錄但不編碼蛋白質(zhì)的RNA[1]。在病原菌與宿主長期的交互作用過程中，病原菌可通過感應(yīng)宿主信號（如溫度、pH值、氧含量、滲透性等）調(diào)節(jié)基因的表達，以適應(yīng)宿主內(nèi)環(huán)境并在宿主內(nèi)生存[2]。傳統(tǒng)觀念認為，原核生物基因表達調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平；但近年來研究發(fā)現(xiàn)，原核生物與真核生物一樣都存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制，而這種調(diào)控與sRNA密切相關(guān)[3]。目前已在大腸埃希菌、霍亂弧菌、沙眼衣原體、單核細胞增生李斯特菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌以及產(chǎn)氣莢膜梭菌等多種細菌中發(fā)現(xiàn)了sRNA[4]。sRNA在調(diào)控細菌基因表達方面具有重要作用。相對于轉(zhuǎn)錄因子在生物體中對基因的表達調(diào)控，sRNA介導(dǎo)的基因表達調(diào)控可使細菌對外界環(huán)境變化作出更快速的應(yīng)答。當致病菌進入宿主內(nèi)感應(yīng)宿主微環(huán)境變化，可通過sRNA調(diào)整自身毒力基因的表達，促進致病菌在宿主內(nèi)的生存能力，利于致病菌對宿主的侵襲及致病[5]。目前已發(fā)現(xiàn)多種與細菌的毒力及致病性相關(guān)的sRNA，這些sRNA作為細菌毒力調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要組成部分，在轉(zhuǎn)錄后水平精細調(diào)節(jié)細菌毒力及其致病機制。本文就sRNA調(diào)控細菌毒力的分子機制及其在常見病原菌致病過程中的作用作一概述。

1 sRNA調(diào)控細菌毒力的分子機制

細菌sRNA作為一種重要的基因表達調(diào)控元件，在轉(zhuǎn)錄后層面精密調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達水平，其調(diào)控細菌毒力表達的主要分子機制可分為以下3種。

1.1 堿基互補配對機制

細菌sRNA與靶mRNA堿基互補配對結(jié)合，調(diào)節(jié)靶標mRNA的翻譯或影響其穩(wěn)定性，促進或降低mRNA的降解，這是sRNA發(fā)揮調(diào)控功能的最主要機制。

1.1.1 順式編碼的sRNA 順式編碼的sRNA通常是由其所調(diào)控靶標基因的互補鏈轉(zhuǎn)錄而來，并且能夠與其調(diào)控的靶標基因形成完全互補配對。目前順式編碼sRNA在質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子及染色體中均有發(fā)現(xiàn)，可與靶標mRNA完全互補配對調(diào)控目標基因的表達，這些基因多為毒力相關(guān)的基因[6-7]。例如枯草芽孢桿菌的抗毒素sRNA RatA與txpA mRNA堿基互補配對后，在RNase Ⅲ的協(xié)同作用下，介導(dǎo)txpA mRNA降解，進而抑制毒素TxpA的合成[8]。大腸埃希菌抗毒素sRNA RdlD通過與ldrD mRNA堿基互補配對，抑制ldrD mRNA翻譯起始或影響其穩(wěn)定性，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控毒素ldrD的表達[6]。

1.1.2 反式編碼的sRNA 反式編碼的sRNA通常由細菌染色體中與其所調(diào)控靶基因不相鄰的基因區(qū)轉(zhuǎn)錄而來[9]，通常對靶基因起負性調(diào)控作用，能夠與靶標mRNA通過不完全的堿基互補配對方式結(jié)合，這種堿基互補配對通常位于mRNA的5’-非翻譯區(qū)（5’-untranslated regions，5’-UTR），覆蓋核糖體的結(jié)合位點；或者通過促進RNase介導(dǎo)的降解作用，影響靶標基因的表達[10]。一些sRNA還可與mRNA SD/ AUG上游區(qū)域互補配對，破壞其二級結(jié)構(gòu)，暴露核糖體結(jié)合位點，激活靶標基因的表達[11]。反式編碼sRNA在轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控過程通常需要RNA伴侶蛋白Hfq的協(xié)助。Hfq促進sRNA與其靶標mRNA互補配對，保護sRNA穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)靶標基因的翻譯或穩(wěn)定性[12]。

1.2 調(diào)控蛋白質(zhì)活性

sRNA除了通過與靶標mRNA堿基互補配對來調(diào)控基因的表達以外，還可通過模仿核酸結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性，影響毒力基因的表達[13]。CsrA（RsmA）蛋白家族作為RNA結(jié)合蛋白，可以與靶標mRNA的5’-UTR區(qū)域結(jié)合，調(diào)控靶基因的翻譯或其穩(wěn)定性，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控毒力因子表達。sRNA CsrB和CsrC序列中存在多個CrsA結(jié)合位點，能夠被CrsA識別并結(jié)合，進而與CrsA的靶標mRNA競爭，使CsrA與靶標mRNA解離，抑制CsrA的調(diào)控作用，從而調(diào)控下游基因的表達。在銅綠假單胞菌中，sRNARsmY和RsmZ通過同樣的方式調(diào)控RsmA蛋白的活性[14-15]。大腸埃希菌RNA聚合酶的σ亞基可識別基因啟動子區(qū)域，啟動轉(zhuǎn)錄。6SRNA可模擬啟動子并與σ亞基結(jié)合，從而改變RNA聚合酶的活性，影響轉(zhuǎn)錄過程[16]。

1.3 行使管家功能的sRNA

除了上述sRNA之外，還有一種具有管家功能的sRNA，包括轉(zhuǎn)運信使RNA（transfer-messenger RNA，tmRNA）、M1 RNA和4.5S RNA，是細菌行使生物學(xué)功能必需的sRNA。tmRNA在蛋白質(zhì)合成過程中具有質(zhì)量控制作用，當翻譯出現(xiàn)錯誤時，tmRNA可將滯留的核糖體解脫并介導(dǎo)缺陷蛋白質(zhì)水解。tmRNA還可以在細菌基因表達以及應(yīng)對環(huán)境壓力等方面發(fā)揮重要功能[17]。M1 RNA是組成RNaseP的亞單位，RNaseP對細菌轉(zhuǎn)運RNA（transfer RNA，tRNA）前體5’末端進行剪切，促進tRNA成熟。4.5S RNA是信號識別顆粒的組成部分，參與識別核糖體上新生肽的信號序列[18]。

2 sRNA在調(diào)控細菌致病性中的作用

2.1 大腸埃希菌

大腸埃希菌是在細菌sRNA研究中使用最多的模式菌，目前已發(fā)現(xiàn)多種與其致病調(diào)控相關(guān)的sRNA。調(diào)節(jié)蛋白CsrA是Csr系統(tǒng)（碳儲存調(diào)節(jié)系統(tǒng)）的中心組件，能夠在碳饑餓、群體感應(yīng)、糖原合成、乙酸代謝、菌毛合成及細菌毒力調(diào)控等多方面發(fā)揮作用。目前發(fā)現(xiàn)CsrB及CsrC兩種sRNA能夠在細菌指數(shù)生長期拮抗CsrA活性并抑制細菌生長穩(wěn)定期的多種代謝通路[19]。另一種sRNA—RyhB在大腸埃希菌鐵代謝調(diào)控中具有重要作用。當鐵離子濃度高時，F(xiàn)e2+-Fur蛋白（鐵攝取調(diào)節(jié)子）可與ryhB基因結(jié)合，阻止RyhB轉(zhuǎn)錄。當鐵離子濃度低時，F(xiàn)ur蛋白與鐵離子解離，構(gòu)象發(fā)生改變，不能與ryhB基因結(jié)合，失去對ryhB基因的轉(zhuǎn)錄阻遏作用，RyhB進而與多種鐵結(jié)合蛋白mRNA結(jié)合，調(diào)節(jié)細菌對鐵的吸收[20]。對致病性大腸埃希菌CFT073的研究表明，RyhB還與細菌定植密切相關(guān)。在鼠尿路感染模型中，ryhB缺陷株在膀胱的定植能力顯著降低[21]。腸出血性大腸埃希菌是出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒綜合征的病原菌，其毒力因子主要由LEE毒力島基因編碼而成，包括LEE1-LEE5共5個操縱子。sRNA GlmY和GlmZ能夠干擾LEE4以及LEE5的轉(zhuǎn)錄，同時促進效應(yīng)器EspFu的翻譯，而EspFu在A/E損傷（腸出血性大腸埃希菌黏附到宿主腸道上皮細胞，與宿主細胞相互作用，介導(dǎo)宿主細胞的黏附與擦拭性損傷即A/E損傷）形成的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要功能。除了上述兩種sRNA外，腸出血性大腸埃希菌還有幾種獨特的sRNA，如Esr41可調(diào)節(jié)菌毛的表達及細菌活性，AsxR及AgvB分別參與調(diào)節(jié)血紅素加氧酶及氨基酸代謝活性[22]。

2.2 金黃色葡萄球菌

RNAⅢ是金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)的第1個與細菌致病毒力調(diào)控相關(guān)的sRNA。RNAⅢ的長度為514 nt，由14個莖環(huán)結(jié)構(gòu)折疊而成，具有雙重功能，既可作為mRNA編碼δ-溶血素，又能作為調(diào)控因子調(diào)控多個毒力相關(guān)基因的表達。RNAⅢ5’端與呈折疊狀態(tài)的hla mRNA二級結(jié)構(gòu)結(jié)合時，暴露出核糖體結(jié)合位點，激活α-溶血素的表達[2,23-24]。RNAⅢ3’端包含3個冗余的富含C序列的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，能與靶mRNA的核糖體結(jié)合位點的G序列結(jié)合，以阻止核糖體就位，并與RNaseⅢ共同作用誘導(dǎo)靶mRNA快速降解。這些靶mRNA包括spa、coa、SA1000及rot mRNA。spa mRNA及coa mRNA分別編碼蛋白A及凝固酶。蛋白A是該菌表面的主要黏附素，SA1000 mRNA編碼黏附素樣蛋白因子，在金黃色葡萄球菌黏附和侵染表皮細胞時發(fā)揮重要功能。rot mRNA編碼毒素轉(zhuǎn)錄抑制物Rot，通過抑制Rot的合成，RNAⅢ可調(diào)控下游毒力基因的表達，間接激活許多外毒素的轉(zhuǎn)錄?？梢奟NAⅢ能夠在轉(zhuǎn)錄后水平與靶mRNA直接結(jié)合，抑制細胞表面黏附素的合成；而在轉(zhuǎn)錄水平上，通過抑制Rot的合成間接激活外毒素表達[24-26]。

2.3 單核細胞增生李斯特菌

在單核細胞增生李斯特菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種與毒力表達調(diào)控相關(guān)的sRNA。sRNA LhrA通過與chiA mRNA堿基互補配對，干擾核糖體就位，抑制其轉(zhuǎn)錄，在轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)控chiA（編碼殼質(zhì)酶）的表達[27]。ChiA是單核細胞增生李斯特菌致病相關(guān)的重要毒力因子，可通過抑制宿主的先天免疫應(yīng)答來提高細菌的毒力[28]。LhrA對ChiA的調(diào)控作用依賴于毒力調(diào)節(jié)因子PrfA和σB的參與。LhrC是該菌中另一個與毒力調(diào)控相關(guān)的sRNA，可通過與lapB mRNA互補配對負性調(diào)控LapB的表達。LapB是一種與細菌致病毒力相關(guān)的胞壁蛋白。在血液中，LhrC高表達抑制lapB的表達，可使細菌逃避宿主的免疫系統(tǒng)[29]。研究[30]發(fā)現(xiàn)，Rli31、Rli33-1和Rli50 sRNA與單核細胞增生李斯特菌的致病毒力相關(guān)，這3株sRNA缺失株在小鼠和昆蟲感染模型中的毒力均顯著下降。

2.4 產(chǎn)氣莢膜梭菌

產(chǎn)氣莢膜梭菌中的sRNA VR-RNA（VirR調(diào)節(jié)RNA）是VirR/VirS 雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)的二級RNA調(diào)節(jié)子，能夠調(diào)控（正性或負性）多種毒力因子的表達。VirR/VirS-VR調(diào)控級聯(lián)可以正調(diào)控多種毒力相關(guān)基因，包括plc（編碼α-毒素）、colA（編碼κ-毒素）、nagL（編碼透明質(zhì)酸酶），nanI及nanJ（編碼唾液酸酶）；還可以調(diào)控多種毒力相關(guān)操縱子的表達，對nanE-nanA操縱子有正調(diào)控作用，對與莢膜多糖合成相關(guān)的操縱子（CPE0474-CPE0490、CPE0491-CPE0497、CPE0500-CPE0502）則呈負性調(diào)節(jié)[31-32]。VirX是產(chǎn)氣莢膜梭菌中第2個與毒力因子調(diào)控相關(guān)的sRNA，能夠調(diào)控毒力基因pfoA（編碼θ-毒素）、plc及colA的表達[33]。

2.5 銅綠假單胞菌

GacS-GacA-RsmY-Z-RsmA傳導(dǎo)通路在調(diào)控銅綠假單胞菌的致病毒力方面具有重要作用[23]。GacSGacA雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)可正性調(diào)節(jié)sRNA RsmY和RsmZ的表達。RsmA是一種RNA結(jié)合蛋白，sRNA RsmY/ RsmZ能夠與其結(jié)合，解除RsmA與靶標mRNA的結(jié)合，促進靶標mRNA的翻譯。RsmA作為一種翻譯調(diào)節(jié)蛋白，能夠調(diào)控多種毒力相關(guān)基因的表達，包括與綠膿菌素、氰化氫及PA-IL凝集素合成相關(guān)的基因[34-36]。此外，RsmA在銅綠假單胞菌致急性感染向慢性感染轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮重要作用。RsmA可上調(diào)銅綠假單胞菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)和Ⅳ型菌毛的合成及鞭毛的活力，抑制Ⅵ型分泌系統(tǒng)及生物膜的形成能力[14,37]。氮源調(diào)節(jié)的sRNA NrsZ能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)rhlA（合成鼠李糖）基因的表達，進而調(diào)控銅綠假單胞菌的群集運動，影響其活力[38]。

2.6 沙眼衣原體

沙眼衣原體是一種專性細胞內(nèi)寄生的原核微生物，具有獨特的細胞內(nèi)二相生活周期，即有感染性而沒有代謝活性的原體和只有代謝活性而沒有感染性的網(wǎng)狀體，這兩種形式的相互分化由在分化周期后期表達的組蛋白樣蛋白HctA所調(diào)控。HctA伴隨著網(wǎng)狀體向原體分化過程而表達，通過調(diào)整DNA拓撲結(jié)構(gòu)或與DNA或RNA結(jié)合來抑制轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。sRNA IhtA通過與hctA mRNA結(jié)合調(diào)控HctA的表達。當沙眼衣原體入侵宿主細胞后，由原體形式分化為網(wǎng)狀體形式，IhtA表達上升，HctA蛋白合成水平下降；當由網(wǎng)狀體形式向原體分化時，IhtA轉(zhuǎn)錄水平下降，而HctA蛋白的表達上升[39-40]。

2.7 化膿性鏈球菌

化膿性鏈球菌是一種機會致病菌，可產(chǎn)生多種毒力因子，包括毒素和侵襲性酶等。這些毒力因子可由多種調(diào)控機制所調(diào)控，其中sRNA有重要作用。在化膿性鏈球菌中，有3種主要的sRNA參與其毒力因子的調(diào)控過程。sRNA Fasx是fasBCAX操縱子的一員，該操縱子編碼兩種組氨酸鏈激酶（FasB和FasC）和一種反應(yīng)調(diào)節(jié)因子（FasA）。sRNA FasX可在轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)化膿性鏈球菌表面的菌毛合成能力，降低其對宿主細胞的黏附能力，同時上調(diào)外分泌毒力因子鏈激酶的表達。在感染過程中，F(xiàn)asX可促進細菌由定植階段向擴散階段進展[41-42]。Klenk等[43]研究表明，F(xiàn)asx能夠通過影響細菌黏附、細胞因子基因的轉(zhuǎn)錄及釋放、宿主細胞的凋亡來調(diào)控化膿性鏈球菌與喉上皮細胞的相互作用。sRNA Pel類似于金黃色葡萄球菌中sRNA RNAⅢ，具有雙重功能，既能編碼蛋白質(zhì)，又對多種毒力因子具有調(diào)控作用。sRNA Pel能夠在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因emm（編碼M蛋白）、nga（編碼NAD-糖水解酶）和sic（編碼鏈球菌補體系統(tǒng)抑制劑），同時在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因speB（編碼半胱氨酸蛋白酶SpeB）[44]。sRNA RivX能夠與調(diào)節(jié)蛋白RivR協(xié)同作用正性調(diào)控毒力相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，包括基因emm、sic、speB、scpA（C5a肽酶）、fba（纖連蛋白結(jié)合蛋白）、scl（膠原蛋白樣蛋白）及mga（轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Mga）。上述基因直接或間接被轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Mga所激活[45]。

3 口腔細菌中的sRNA

近年來，運用高通量RNA-seq測序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測，在口腔相關(guān)致病菌中發(fā)現(xiàn)了大量sRNA，但僅有極少數(shù)sRNA的功能被闡明。變異鏈球菌是口腔生物膜中常見的致齲菌，已發(fā)現(xiàn)有多個sRNA[46-48]，但其在轉(zhuǎn)錄后層面調(diào)節(jié)靶基因的表達機制尚不清楚。Koyanagi等研究[49]發(fā)現(xiàn)，反義sRNA在染色體的毒素-抗毒素（toxin-antitoxin，TA）系統(tǒng)中具有重要調(diào)節(jié)作用。變異鏈球菌存在由Fst樣毒素（Fst-Sm）及順式編碼sRNA（srSm）組成的Ⅰ型TA系統(tǒng)（Fst-Sm/srSm），順式編碼的sRNA可通過與毒素mRNA的核糖體結(jié)合位點結(jié)合調(diào)控毒素的表達。變異鏈球菌細菌毒素的過表達可被共表達的sRNA抗毒素中和。通過基因工程手段過表達變異鏈球菌Fst-Sm/srSm系統(tǒng)可減少群落內(nèi)耐受細胞壁合成抑制劑的細菌數(shù)量[49]。在牙齦卟啉單胞菌中也已發(fā)現(xiàn)多種sRNA[50-51]。Amarasinghe等[52]在伴放線菌聚集桿菌中發(fā)現(xiàn)4種受鐵離子及轉(zhuǎn)錄因子Fur調(diào)控的sRNA，其中sRNA JA03過表達會引起細菌生物膜形成能力的下降。

盡管目前已發(fā)現(xiàn)上百種細菌sRNA，但僅有小部分sRNA的生物學(xué)功能得以闡釋。進一步鑒定細菌sRNA的靶基因，闡明sRNA的激活途徑、交互作用網(wǎng)絡(luò)及其對靶基因的作用模式與機制將有助于全面深入理解細菌sRNA在轉(zhuǎn)錄后層面精細調(diào)控細菌生理功能的能力。隨著高通量實施測序技術(shù)的發(fā)展，sRNA的調(diào)控機制及網(wǎng)絡(luò)會得以更加深入地研究，有望為細菌毒力控制及細菌相關(guān)性感染性疾病的控制提供新的思路與模式。

來源：《華西口腔醫(yī)學(xué)雜志》2016年8月第34卷第4期