摘要

目的：檢驗(yàn)甲狀旁腺激素1受體（PTH1R）突變?cè)谠l(fā)性和恒牙期均有療效的假說。

材料和方法：從29名患者（8名家族患者和21名零星患者）的唾液樣本中提取DNA，這些患者提供牙齒缺失的臨床證據(jù)，以及未受影響的親屬（N = 22）。 對(duì)所有個(gè)體完成序列測(cè)定，然后對(duì)PTH1R基因的編碼區(qū)進(jìn)行突變分析（N = 29）。

結(jié)果：29例中有8例在PTH1R基因中發(fā)現(xiàn)雜合致病變異體;基于與dbSNP，HGMD和ESP數(shù)據(jù)庫(kù)的比較，八個(gè)變體中的五個(gè)表示不同的突變。發(fā)現(xiàn)一個(gè)突變（c.1765 T＞C p.Trp89Arg）在家族內(nèi)分離（n = 3）。所有變體的計(jì)算機(jī)分析揭示了推定的致病作用。據(jù)報(bào)道，PTH1R中的功能性突變定義了基因型-表型相關(guān)性，并且僅對(duì)一個(gè)或多個(gè)后牙有相應(yīng)的影響; 單側(cè)或雙側(cè)受累，阻斷乳牙。

結(jié)論：PTH1R基因中報(bào)道了新的突變，包括受PFE影響的原發(fā)磨牙，從而為使用遺傳診斷工具進(jìn)行早期診斷提供適當(dāng)?shù)墓芾硪罁?jù)。（Angle Orthod。2018; 88：275-282。）

關(guān)鍵詞：原發(fā)性萌出失?。≒FE）；牙萌出；PTH1R

1、引言

牙齒萌出是發(fā)育過程，由此骨內(nèi)隱窩內(nèi)發(fā)育的牙齒穿過頜骨進(jìn)入口腔，直到達(dá)到功能性閉合。牙醫(yī)和正畸醫(yī)生的作用是監(jiān)測(cè)牙斑的發(fā)生模式，以避免隨后出現(xiàn)的咬合問題，萌出障礙。 普通牙醫(yī)或牙科專家遇到由萌出障礙引起的咬合問題的患者并不罕見。 小兒牙科和正畸專家會(huì)定期監(jiān)測(cè)正常牙齒萌出中的差異，如時(shí)間，次序和萌出程度。

正常的萌出過程需要牙齒以精確的雙側(cè)時(shí)間順序通過骨骼和口腔上皮，這必須與三個(gè)空間平面中的上頜骨和下頜骨的生長(zhǎng)協(xié)調(diào)。（1）骨吸收，（2）牙齦吸收（二者都在牙囊上方）和（3）在毛囊頂端的根伸長(zhǎng)。骨吸收是破骨細(xì)胞生成的結(jié)果，不需要牙齒萌出的力量，而是一種遺傳程序化的過程。這種吸收和替代過程之間平衡的改變是主要的萌出失?。≒FE）發(fā)展的決定性因素。然而，最近的研究將基因發(fā)現(xiàn)作為揭示PFE機(jī)制基礎(chǔ)的重要邏輯第一步。

PFE這個(gè)術(shù)語(yǔ)是由Proffit和Vig（1981）提出的，表明萌出機(jī)制中的一個(gè)缺陷不是由于明顯的阻塞造成的。在大多數(shù)情況下，受PFE影響的牙齒部分萌出（supracrestally），然后在它們達(dá)到功能性閉塞之前被阻滯?；赑FE受影響隊(duì)列的臨床和基因特征，與其他萌出性疾病相比，提供了一個(gè)診斷標(biāo)準(zhǔn)。這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)定義了確定萌出途徑是否清晰的至關(guān)重要的第一步。也就是說，應(yīng)該使用當(dāng)前和歷史臨床X光片和照片來排除機(jī)械阻塞的存在。這包括了解過去的阻塞是否導(dǎo)致受影響的牙齒的當(dāng)前受限位置。第二步是確定是否至少有一個(gè)第一磨牙受到影響。不同頻率發(fā)生的其他特征包括主要受影響的后牙，主要牙和恒牙的受累，單側(cè)或雙側(cè)發(fā)生傾向于施加正畸力后發(fā)生關(guān)節(jié)僵硬，以及沒有全身受累。

自從發(fā)現(xiàn)PTH1R基因負(fù)責(zé)PFE的發(fā)展以來，文獻(xiàn)繼續(xù)在PTH1R中聚集PFE相關(guān)的突變。 揭開基因型 - 表型相關(guān)性的道路仍然相當(dāng)難以捉摸，甚至更令人困惑，因?yàn)橛蒔TH1R突變引起的疾病譜非常廣泛。事實(shí)上，PTH1R基因突變與致死性侏儒癥，軟骨發(fā)育不良和萌出特異性牙齒疾病相關(guān)。對(duì)這種類似突變表型譜的完整理解是神秘的，需要對(duì)PTH1R基因的結(jié)構(gòu)和功能有完整的理解。

該基因位于染色體3p21-p22.1，MIM＃上，含有16個(gè)外顯子。由此產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是跨膜糖蛋白（593個(gè)氨基酸），由延伸的細(xì)胞外配體結(jié)合氨基末端，細(xì)胞內(nèi)G蛋白相關(guān)羧基末端結(jié)構(gòu)域，由28個(gè)氨基酸形成的信號(hào)肽，具有150個(gè)氨基酸的具有激素結(jié)合位點(diǎn)的胞外結(jié)構(gòu)域，以及包含7個(gè)α-螺旋和胞間結(jié)構(gòu)域的跨膜結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合兩種不同的配體：甲狀旁腺激素（PTH），主要作用于肝臟和骨細(xì)胞以及甲狀旁腺激素相關(guān)肽（PTHrP）。這兩種配體均可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣水平并有利于骨代謝，PTH僅由甲狀旁腺產(chǎn)生。然而，許多組織產(chǎn)生PTHrP和細(xì)胞類型，包括內(nèi)皮細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，骨骼，肝臟，平滑肌細(xì)胞和牙胚。只有一個(gè)正常的PTH1R拷貝足夠，但必須在大多數(shù)組織。在牙齒發(fā)育中，需要大量的PTH1R15。由于這個(gè)原因，推測(cè)PFE表型可能是PTH1R劑量依賴性失活的結(jié)果。此外，觀察到一些PTH1R基因的常染色體顯性突變不影響除骨關(guān)節(jié)炎以外的牙齒或其他骨骼結(jié)構(gòu)。最近的研究證實(shí)骨關(guān)節(jié)炎與軟骨細(xì)胞中低水平的PTH1R之間存在關(guān)聯(lián)。

這個(gè)后基因組時(shí)代的基因研究的總體目標(biāo)是提供有意義的臨床應(yīng)用來提高診斷的準(zhǔn)確性。 對(duì)PFE的研究繼續(xù)完善萌出性疾病的描述，但對(duì)其發(fā)病機(jī)制的完整理解仍然難以捉摸。 此外，基于對(duì)PFE表型的完整解剖的臨床參數(shù)應(yīng)該包括牙列和顱面結(jié)構(gòu)的基因型：表型相關(guān)性。以前的研究表明，PFE在主要牙列中發(fā)生更少，但始終包括恒牙。在這份報(bào)告中，表現(xiàn)出混合牙列和永久牙列的明顯參與的家庭和多個(gè)人創(chuàng)造了擴(kuò)大診斷窗口，并因此在更早的年齡管理的機(jī)會(huì)。因此，這些發(fā)現(xiàn)標(biāo)志著一個(gè)機(jī)會(huì)來完善PFE和PTH1R的基因型：表型相關(guān)性并提高診斷的準(zhǔn)確性。

2、材料與方法

受試者

一組51名患者（年齡在7至45歲之間）患有家族性萌出性疾病（至少在一名家庭成員中至少有一顆牙包括），被招募參加這項(xiàng)研究。這些患者中有29名具有PFE的特征。招募了22名未受影響的親屬并擔(dān)任對(duì)照受試者。通過（1）由口內(nèi)和口外照片組成的臨床檢查，（2）全景X射線和（3）患者訪談來確定低咬合診斷。萌出性障礙診斷的標(biāo)準(zhǔn)包括先前描述的表型特征，包括PFE類型?；颊叩呐R床檢查在羅馬圣心天主教大學(xué)牙科研究所（UCSC）進(jìn)行，突變研究在 醫(yī)學(xué)遺傳研究所的實(shí)驗(yàn)室和UCSC的牙科研究所。這項(xiàng)研究得到了UCSC倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

突變分析

使用Wizard基因組DNA純化試劑盒（Promega Corp，F(xiàn)itch-burg，Wisc）提取唾液中的DNA。使用針對(duì)所有編碼區(qū)和PTH1R基因的內(nèi)含子-外顯子連接點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物（Genamics Expression 1.1 Bio-Soft.Net Sequence Analysis and Alignment for Windows; 表1）對(duì)所有受試者進(jìn)行序列分析，隨后進(jìn)行PTH1R的突變分析。 用含有血清堿性磷酸酶（SAP）和外切核酸酶的PCR產(chǎn)物預(yù)測(cè)序試劑盒（Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ）純化PCR產(chǎn)物。 用Big Dye Terminator 3.1循環(huán)測(cè)序試劑盒（Life Technologies，Carlsbad，Calif。）進(jìn)行PCR產(chǎn)物的測(cè)序，用Big Dye X-Terminator試劑盒（Life Technologies）純化，并使用自動(dòng)測(cè)序儀AB1 3130 Genetic Analyzer（Life Technologies）。 將變體與dbSNP，HGMD和ESP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較以確定變體是新的還是先前報(bào)道的。

表1.設(shè)計(jì)并用于PCR擴(kuò)增PTH1R基因（退火溫度，558℃）的引物組

硅片分析

序列數(shù)據(jù)使用Mutation Surveyor V3.3進(jìn)行分析。 通過SIFT，PolyPhen2和AlignGVGD評(píng)估未知序列變體。 使用Alamut軟件v.1.5的生物信息學(xué)工具（Interactive Biosoftware，Inc。），基于五種不同算法（SpliceSiteFinder，MaxEntScan，NNSPLICE，GeneSplicer，人類剪接發(fā)現(xiàn)者）評(píng)估懷疑影響正確剪接的變體的剪接位點(diǎn)強(qiáng)度或分支點(diǎn)預(yù)測(cè)。http://www.interactive-biosoftware.com/alamut.html）。 通過使用專用軟件Sorting Intolerant from Tolerant（SIFT）和Phenotyping（PolyPhen-2），使用計(jì)算機(jī)分析來評(píng)估蛋白質(zhì)的折疊和這種變體的最終致病性。

3、結(jié)果

突變和硅分析

表2. PFE患者中的突變總結(jié)

表3.數(shù)據(jù)庫(kù)

29例中有8例在PTH1R基因中發(fā)現(xiàn)雜合致病變異。表2顯示了本研究中確定的突變概況。簡(jiǎn)言之，在8個(gè)受影響的受試者中有5個(gè)鑒定出三種錯(cuò)義突變，這些受試者以前沒有根據(jù)與已發(fā)表的數(shù)據(jù)庫(kù)的比較（表3）進(jìn)行描述。在兩個(gè)兄弟中鑒定出CTCF結(jié)合位點(diǎn)的變體（c.313×32 A.G rs113566258 SNP）（圖1A，B）。

圖1.（A，B）兩兄弟的口內(nèi)照片。全景：外顯子5的下游變體（CTCF結(jié)合位點(diǎn)）rs113566258 SNPc.313±32A＞G; 在外顯子16中的變體（位置3：46903467）c.1593-95 Del C，p.531 / 532; 外顯子10中的同義變體（位置3：46899419）c.1152 G＞A.

兄弟姐妹被診斷為I型PFE并顯示雙邊呈現(xiàn)。該變體（PTH1R基因的外顯子5的下游c.313×32 A.G）發(fā)生在與轉(zhuǎn)錄因子相互作用的調(diào)節(jié)區(qū)中。除了這種突變之外，這些兄弟還受到第二個(gè)突變的影響，這些突變對(duì)每一個(gè)都是獨(dú)特的：一個(gè)兄弟姐妹（II：1）也存在在外顯子16的基因氨基末端發(fā)生的移碼缺失，c.1593DelC ，第（Pro532Leufs *）（圖1A，B）。在另一個(gè)同胞（II：3）中，鑒定出在蛋白質(zhì)氨基酸序列水平不引起變異的外顯子，c.1152GA（rs200475872;圖1A，B）中的同義變體，但涉及改變含氮堿。基于計(jì)算機(jī)分析，這種改變可能會(huì)影響mRNA的折疊并影響其半衰期和蛋白質(zhì)生產(chǎn)。在這個(gè)患者樣本中，在一個(gè)孤立的病例中發(fā)現(xiàn)了同樣的同義變體c.1152G.A，由于PFE而具有嚴(yán)重的開合（圖2）。

圖2.口內(nèi)照片。全景：外顯子10中的同義變體（位置3：46899419）c.1152 G＞A.

在PFE的另一個(gè)孤立案例中，重新發(fā)生錯(cuò)義突變，c.64 C＞T p。 先前未描述的Ala22Val在外顯子3中發(fā)現(xiàn)。這種變體發(fā)生在信號(hào)肽水平的PTH1R蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域中，并且它確定了氨基酸的變化。但是，由于兩個(gè)氨基酸具有相同的電荷，所以該突變不被認(rèn)為是高致病性的。

最后，在數(shù)據(jù)庫(kù)中以前沒有報(bào)道的錯(cuò)義變體在外顯子16 c.1765 T＞C p.Trp89Arg中發(fā)現(xiàn)。 在同一家庭的三個(gè)成員 - 母親，女兒和兒子（圖3A，B）中發(fā)現(xiàn)的錯(cuò)義變體-負(fù)責(zé)用精氨酸p：Trp89Arg取代氨基酸色氨酸，這是一種具有不同化學(xué)特性的氨基酸。該突變發(fā)生在PTH1R蛋白質(zhì)的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中，并參與受體與激活細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)信號(hào)的G蛋白的相互作用。此外，計(jì)算機(jī)結(jié)果表明，PTH1R蛋白質(zhì)中的這種氨基酸取代改變了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，因?yàn)樗l(fā)生在蛋白質(zhì)的催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)。

圖3.（A，B）兩兄弟的口內(nèi)照片。全景：外顯子16中的家族錯(cuò)義變體c.1765 T＞C p.589 W＞R

屬于2號(hào)家庭的小女兒（2：2）表現(xiàn)出更復(fù)雜的臨床表現(xiàn)，缺乏永久性以及暫時(shí)性系列和囊性結(jié)構(gòu)元素的萌出（圖3A，B）。在哥哥（II：1;圖3A，B）中發(fā)現(xiàn)由于包括多顆恒牙的嚴(yán)重的雙側(cè)后牙開合。最后，患者II：1和II：2的母親表現(xiàn)出雙側(cè)上頜第一磨牙和下磨牙的包埋。發(fā)現(xiàn)前磨牙層面沒有咬合接觸（圖3A，B）。

臨床表現(xiàn)

本研究中確定的低咬合的臨床特征與PFE基于基因診斷和萌出障礙診斷標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用相一致。對(duì)特定相關(guān)牙科特征的仔細(xì)臨床檢查包括以下內(nèi)容：至少一顆牙包括低咬合，局限于后部區(qū)域，單側(cè)（38％;圖1A）和雙側(cè)呈現(xiàn)（35％;圖1B和2），至少有一個(gè)暫時(shí)性后牙（48％暫時(shí);圖1A，B和3A; 55％永久性，圖3B）。此外，觀察到牙面特征如下：由于受影響側(cè)的側(cè)向開放咬傷的嚴(yán)重程度而引起的垂直骨骼不對(duì)稱（35％;圖1A，B和圖3A，B）;由下頜骨側(cè)向偏離組成的面部不對(duì)稱（圖1A，B和圖2;表4）。這種不對(duì)稱在單側(cè)開合患者中更為明顯。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)受影響的患者與先前報(bào)道的患者存在上頜骨收縮和III類牙齒/骨骼關(guān)系（28％;圖1A，B和圖2）。至少有一例患者出現(xiàn)了相對(duì)于9名患者的低咬合。表4總結(jié)了PTH1R的表型結(jié)果和相關(guān)的突變分析（N = 8）。

表4. PTH1R突變患者特征總結(jié)

4、討論

在這項(xiàng)研究中，確定了五種突變：先前報(bào)道了三種新型和兩種突變（rs113566258和rs20047872）。PTH1R改變包括（1）轉(zhuǎn)錄因子（CTCF結(jié)合位點(diǎn)）結(jié)合的基因調(diào)節(jié)區(qū)水平的變體，（2）移碼缺失，（3）同義變體和（4）兩種錯(cuò)義變體。估計(jì)某些變體的致病性是困難的，但是通過在導(dǎo)致產(chǎn)生截短蛋白的那些變體中的計(jì)算機(jī)分析中支持PTH1R基因突變和PFE之間的原因-和效應(yīng)關(guān)系。 未來的功能研究將對(duì)本報(bào)告中描述的突變的后果提供更詳細(xì)的分析。

本次隊(duì)列研究對(duì)孤立性和家族性病例進(jìn)行了調(diào)查，其中包括五個(gè)家族，其中一個(gè)以上成員受到至少一個(gè)磨牙癥的影響。這項(xiàng)研究的一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是，在兩個(gè)家庭和三名不相關(guān)的患者中發(fā)現(xiàn)的變體與混合牙列中的低咬合有關(guān)。與混合牙列中的PFE呈正相關(guān)，因此該發(fā)現(xiàn)支持了在混合牙列階段期間早期基因診斷的方案的發(fā)展。

這些結(jié)果標(biāo)志著混合牙列參與PTH1R基因功能性突變的個(gè)體的最全面文件。家族2中發(fā)現(xiàn)的錯(cuò)義突變與報(bào)道的類似，并且也顯示出類似的表型。雖然強(qiáng)調(diào)家族遺傳作為檢測(cè)PFE的一個(gè)引人注目的標(biāo)志，但本研究的結(jié)果支持調(diào)查包括原發(fā)性牙齒和家族史作為改善早期檢測(cè)的綜合方法。發(fā)現(xiàn)一個(gè)c.1092delG，一個(gè)年輕男孩和他的父母的移碼突變，顯示了混合牙列的參與，導(dǎo)致截?cái)嗟鞍椎腸.1092delG變體也與骨骼和牙齒三類錯(cuò)（牙合）相關(guān)，導(dǎo)致 溫和的開放式咬合在右側(cè)。本報(bào)告通過鑒定多個(gè)家族的新型突變（圖1A，B）擴(kuò)大了Rhoads等人的發(fā)現(xiàn)。

5、結(jié)論

這項(xiàng)研究的結(jié)果證實(shí)，PTH1R基因的突變導(dǎo)致萌出失敗，其臨床表現(xiàn)與之前對(duì)PFE的描述一致。這些表型可以在乳牙的水平早期發(fā)現(xiàn)，然后在恒牙列中發(fā)現(xiàn)。

臨床診斷結(jié)合PTH1R基因的遺傳分析不僅可以確保早期診斷，還可以作為篩查潛在受影響親屬的警報(bào)。

總而言之，PFE的頻率和顯示PTH1R基因遺傳異質(zhì)性的患者數(shù)量表明由PTH1R中的突變引起的PFE被低估。

基于這些觀察結(jié)果，基因引導(dǎo)正畸可以帶來臨床，治療甚至經(jīng)濟(jì)上的優(yōu)勢(shì)，以管理牙齒萌出的問題。

通過基因檢查可以指導(dǎo)臨床醫(yī)生制定正確的正畸治療計(jì)劃，避免導(dǎo)致失敗并使他們?cè)馐茚t(yī)源性損傷所帶來的不必要的和長(zhǎng)期的治療。

來源：浙一口腔正畸林軍