[摘要]  

目的  

探討CCL5/CCR5生物軸在涎腺腺樣囊性癌（SACC）細胞嗜神經(jīng)侵襲中的作用。方法  應(yīng)用細胞免疫熒光技術(shù)和流式細胞術(shù)檢測SACC-LM細胞中趨化因子受體CCR5的表達；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測周圍神經(jīng)細胞培養(yǎng)上清液中趨化因子CCL5的表達。應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測CCL5對SACC-LM細胞內(nèi)F肌動蛋白的作用，并通過劃痕和侵襲實驗觀察趨化因子CCL5和其受體CCR5對SACC-LM細胞運動能力和侵襲能力的作用。結(jié)果   SACC-LM細胞高表達趨化因子受體CCR5；周圍神經(jīng)原代培養(yǎng)上清液中趨化因子CCL5質(zhì)量濃度為（359.2±15.8）、（696.4±22.6） pg·mL-1；趨化因子CCL5和其受體CCR5結(jié)合后對SACC-LM細胞的運動能力和侵襲能力可以產(chǎn)生促進作用。結(jié)論   CCL5/CCR5生物軸可能在SACC細胞嗜神經(jīng)侵襲中起著重要的作用。

[關(guān)鍵詞]  

唾液腺； 涎腺腺樣囊性癌； CCL5； CCR5； 嗜神經(jīng)侵襲

涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是一種較少見的惡性腫瘤，對周圍神經(jīng)侵襲的傾向性被視為SACC的特征性生物學行為之一[1]。在臨床上，周圍神經(jīng)侵襲（peripheral nerve invasion，PNI）與SACC的擴散、復發(fā)和預(yù)后密切相關(guān)[2-3]。在對SACC周圍神經(jīng)侵襲性的研究中，國內(nèi)外學者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多相關(guān)蛋白分子，但仍不能完全解釋SACC嗜神經(jīng)侵襲的機制，隨著“腫瘤微環(huán)境”學說的出現(xiàn)，學者們逐漸將其機制的研究回歸系統(tǒng)化，而不再考慮單一蛋白分子的作用。因此，為了更好地詮釋PNI的作用機制，需要有更多的相關(guān)蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)和研究，以完善PNI的“侵襲相關(guān)系統(tǒng)”。

Virchow于1863年首先報告慢性炎癥與腫瘤之間存在密切的關(guān)系[4]。近幾年隨著炎癥因子與腫瘤之間關(guān)系研究的不斷深入，趨化因子與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究越來越受到人們的重視。申志遠等[5]通過對臨床病理標本的研究發(fā)現(xiàn)：趨化因子受體CCR5在人SACC組織中高表達，且與SACC的嗜神經(jīng)侵襲性密切相關(guān)。本研究旨在以前期病理標本研究為基礎(chǔ)，通過細胞實驗觀察趨化因子CCL5/CCR5生物軸對SACC細胞系SACC-LM的趨化性和侵襲性的作用，為CCL5/CCR5生物軸在SACC的PNI中的作用研究提供進一步的理論依據(jù)。

1，材料和方法

1.1 實驗材料      

兔抗人多克隆抗體和CCL5酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒、FITC標記的熒光二抗（PeproTech公司，美國）；Transwell小室（Corning公司，美國）；Matrigel膠（BD公司，美國）；人重組活性蛋白CCL5（上海普欣公司）；羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽抗體（Sigma公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)   

將人SACC細胞系SACC-LM（圖1）置于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，37 ℃，5%CO2孵育箱條件下培養(yǎng)。術(shù)中頸淋巴組織清掃所得人周圍神經(jīng)在無菌條件下采用組織塊法進行原代培養(yǎng)，僅收集細胞培養(yǎng)的上清液。

1.2.2  細胞免疫熒光法檢測趨化因子受體CCR5在SACC-LM細胞中的表達   

將對數(shù)生長期的SACC-LM細胞接種至12 mm×12 mm的小方片上，孵育箱內(nèi)孵育24 h，采用PBS清洗3次，4%的多聚甲醛進行固定15 min，PBS再次清洗3次，0.5%Triton X-100覆蓋細胞，37 ℃孵育10 min，PBS洗滌3次后孵育一抗，即采用1%的BSA將一抗稀釋至所需濃度（1︰100稀釋），滴加至小方片上將細胞覆蓋。置于4 ℃冰箱內(nèi)過夜后次日37 ℃條件下復溫30 min，PBS洗滌3次，然后孵育熒光二抗工作液，將熒光二抗工作液滴加至細胞表面，37 ℃避光孵育2 h，PBS清洗3次，DAPI染色并置于37 ℃

避光環(huán)境下再次孵育15 min，最后避光條件下，PBS清洗3次后，將小方片置于熒光顯微鏡下觀察，以PBS代替一抗稀釋液組作為空白對照組。

1.2.3   流式細胞術(shù)檢測趨化因子受體CCR5在SACC-LM細胞中的表達   

取對數(shù)生長期的細胞，棄培養(yǎng)液后用PBS清洗2次，0.25%胰蛋白酶消化細胞，采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中和胰蛋白酶，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液后再加入含3%胎牛血清的PBS離心清洗1次，將細胞重懸后轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中，1 000 r·min-1離心5 min沉淀細胞后，加入100 μL一抗稀釋液（1︰100），置于37 ℃恒溫孵育箱中孵育30 min，PBS離心清洗2次，加入FITC標記的熒光二抗稀釋液，37 ℃孵育箱中避光孵育30 min，PBS離心清洗2次，4%多聚甲醛固定樣本。以未加一抗稀釋液組作為空白對照組。

1.2.4 ELISA法測定人周圍神經(jīng)細胞原代培養(yǎng)上清液中趨化因子CCL5的含量      

手術(shù)切取的周圍神經(jīng)標本無菌操作下立即放于含有1 000 U·L-1雙抗液的培養(yǎng)基內(nèi)，常溫下放置5 min。顯微鏡下去凈神經(jīng)組織周圍的血塊及黏膜，用組織剪剪成約1 mm×1 mm×1 mm的小塊，貼于25 mL塑料培養(yǎng)瓶壁上，加入適量的含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃恒溫貼壁2 h后翻瓶并加入適量的培養(yǎng)液。細胞爬出后，PBS液清洗3次，加入無血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h，將培養(yǎng)液棄掉更換無血清培養(yǎng)液后培養(yǎng)12 h和24 h，并分別收集上清液。采用CCL5檢測試劑盒檢測樣品中的CCL5表達量。以新鮮的無血清DMEM培養(yǎng)液作為陰性對照，按試劑盒說明書進行操作。每個樣品ELISA法至少檢測3個孔，均數(shù)間的比較采用t檢驗。

1.2.5 流式細胞儀檢測SACC-LM細胞經(jīng)CCL5處理前后細胞內(nèi)F肌動蛋白量的變化   

取對數(shù)生長期的細胞，棄培養(yǎng)液后用PBS清洗2次，0.25%胰蛋白酶消化細胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中和胰蛋白酶，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液后再加入含3%胎牛血清的PBS離心清洗1次，將細胞重懸后轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中，1 000 r·min-1離心5 min沉淀細胞后，加入濃度為100 ng·mL-1的CCL5無血清RPMI1640（200 μL），37 ℃孵育30 min后，離心洗滌2次，滴加羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽抗體（1︰100稀釋）并重懸，37 ℃避光孵育30 min，利用流式細胞儀檢測熒光強度平均值。以加入無血清RPMI1640（200 μL）作為空白對照組。

1.2.6 劃痕實驗觀察CCL5對SACC-LM細胞運動能力的影響   

將細胞以每孔2×105個的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，待細胞長到單層完全融合時，用10 μL Tip槍頭在單層細胞上劃痕，建立細胞劃痕模型，并用PBS清洗2次。加入含CCL5（20 ng·mL-1）的無血清RPMI1640培養(yǎng)基，37 ℃孵育箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，用倒置顯微鏡于0、48 h觀察劃痕愈合程度。以單純加入無血清RPMI1640培養(yǎng)基作為空白對照組。

1.2.7   侵襲實驗觀察CCL5對SACC-LM細胞侵襲能力的影響  

Transwell小室內(nèi)為孔徑8 μm的多聚碳酸酯膜，用Matrigel膠（1︰5稀釋）包被后放置于專用的24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，選用對數(shù)生長期的SACC-LM細胞，血清饑餓12 h后，將細胞放于上室內(nèi)，在下室中，加入600 μL含不同濃度趨化因子CCL5的無血清RPMI 1640培養(yǎng)液（0、10、20、50、100、300、500 ng·mL-1），并將培養(yǎng)板置于孵育箱內(nèi)孵育12 h。每組設(shè)3個復孔，以在下孔中加入不含CCL5的無血清RPMI1640培養(yǎng)液作為空白對照組。取出嵌套小室，將上室多聚碳酸酯膜內(nèi)面的細胞用棉簽擦凈，將膜底面的細胞用多聚甲醛固定，并用蘇木素和伊紅進行細胞染色，顯微鏡下讀取多聚碳酸酯膜底面穿過的細胞數(shù)目。統(tǒng)計學處理：于放大200倍光學顯微鏡下選取5個視野，記錄穿過多聚碳酸酯膜的細胞總數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學分析       

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。P<0.05說明研究結(jié)果的差異具有統(tǒng)計學意義。

2 ，結(jié)果

2.1 細胞免疫熒光法和流式細胞術(shù)檢測趨化因子受體CCR5在SACC-LM細胞中的表達結(jié)果

細胞免疫熒光法和流式細胞術(shù)均發(fā)現(xiàn)SACC-LM細胞可以表達趨化因子受體CCR5（圖2）。

由圖2可見，在細胞免疫熒光實驗中，熒光顯微鏡下觀察趨化因子受體CCR5表達陽性的細胞，呈現(xiàn)出綠色熒光；利用CCR5抗體+流式細胞術(shù)同樣發(fā)現(xiàn)SACC-LM細胞有趨化因子受體CCR5的表達，其陽性表達率為81.9%。

2.2   ELISA測定結(jié)果

ELISA法測定人周圍神經(jīng)細胞原代培養(yǎng)上清液中趨化因子CCL5的表達量為（359.2±15.8）、（696.4±22.6） pg·mL-1，均比空白對照組多（P<0.05）（圖3）。

2.3   流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)F肌動蛋白量的變化        

加入趨化因子CCL5孵育30 min后，利用流式細胞儀檢測SACC-LM細胞內(nèi)F肌動蛋白的熒光表達強度，進而反應(yīng)細胞內(nèi)F肌動蛋白量的多少。實驗組中F肌動蛋白的熒光表達強度為82.8%，明顯高于空白對照組（圖4）。

2.4   劃痕實驗和侵襲實驗結(jié)果        

相同時間段內(nèi)實驗組SACC-LM細胞劃痕模型的愈合速度明顯高于空白對照組（圖5）；侵襲實驗中，加入趨化因子CCL5后各實驗組穿越PC膜的細胞數(shù)目均有明顯上升，當趨化因子CCL5的濃度為20 ng·mL-1時，穿越PC膜的細胞數(shù)最多（圖6）。

3，討論

惡性腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個連續(xù)的、復雜的、系統(tǒng)性的過程，具有高度的特異性，雖然國內(nèi)外學者已經(jīng)證明惡性腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個多因素參與的過程，但不同組織學類型的惡性腫瘤進行特定的侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制尚不清楚。趨化

因子可以調(diào)控細胞的遷移，其與相應(yīng)受體的結(jié)合可以引起細胞骨架蛋白的改變，使得細胞形成更多的偽足，進而促進了細胞的運動性，這是惡性腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的前提條件[6-7]。隨著趨化因子研究的不斷深入，其在惡性腫瘤中的作用已經(jīng)被多數(shù)

學者作為“腫瘤微環(huán)境學說”的重要機制之一。趨化因子CCL5，屬于CC趨化因子家族的成員，具有介導免疫細胞定向趨化的作用[8-9]，其受體有3個，分別是CCR1、CCR3和CCR5，其中以CCL5與CCR5的親和力最強，構(gòu)成了CCL5/CCR5生物軸。國內(nèi)外許多

學者[10-11]認為趨化因子CCL5和其受體CCR5在惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演著重要的角色。有研究[11-12]表明，趨化因子CCL5與前列腺癌、胰腺癌及乳腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究[13-15]發(fā)現(xiàn)CCL5/CCR5生物軸可引起乳腺癌細胞內(nèi)細胞骨架蛋

白的重排，使細胞的運動性增加，促進了癌細胞的浸潤與轉(zhuǎn)移。在筆者前期的實驗[16]中，發(fā)現(xiàn)CCL5/CCR5生物軸存在于人唾液腺SACC和周圍神經(jīng)之間的“微環(huán)境”中，并且通過體外細胞實驗證明趨化因子CCL5可以明顯地促進SACC細胞的趨化和侵襲能

力，這說明CCL5/CCR5生物軸可能在SACC易侵襲周圍神經(jīng)中起著重要作用。但是，CCL5/CCR5生物軸在SACC細胞嗜神經(jīng)侵襲中的具體分子作用機制尚需進一步的研究。

綜上所述，本研究通過細胞免疫熒光技術(shù)證實了趨化因子受體CCR5在SACC-LM細胞中的存在，利用ELISA法檢測到了周圍神經(jīng)細胞可以外分泌趨化因子CCL5。為了觀察趨化因子CCL5對SACC-LM細胞運動能力的影響，筆者通過流式細胞術(shù)檢測到趨化因子

CCL5促進了SACC-LM細胞內(nèi)F肌動蛋白的增多，這是細胞運動性增強的標志之一；而后又在劃痕、侵襲實驗中，從宏觀角度觀察到了CCL5/CCR5生物軸對SACC-LM細胞遷移及侵襲能力的促進作用。以上結(jié)果說明CCL5/CCR5生物軸在SACC細胞嗜神經(jīng)侵襲中可

能扮有重要的角色，有利于進一步研究唾液腺SACC嗜神經(jīng)侵襲的機制。

來源：原創(chuàng) 李添翼 申志遠 華西口腔醫(yī)學雜志