轉(zhuǎn)：姚軍 中華口腔醫(yī)學(xué)雜志

作者：姚軍，張琰君，張佳麗，楊秀娟

作者單位：350002 福州，福建醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院兒童牙科

通信作者：姚軍，Email：[email protected]，電話：0591-83755232

基金項(xiàng)目：福建省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新課題（2012-CX-27）

本文發(fā)表于《中華口腔醫(yī)學(xué)雜志》2015，50（7）：408-412

DOI:10.3760/cma.j.issn.1002-0098.2015.07.006

配方奶粉是供給嬰兒生長(zhǎng)與發(fā)育所需營(yíng)養(yǎng)的人工食品，可作為母乳的替代品。目前，嬰幼兒配方奶粉已被公認(rèn)為是適合嬰幼兒的人工喂養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)品。根據(jù)嬰幼兒配方食品國家標(biāo)準(zhǔn)（GB10765?2010）的規(guī)定，配方奶粉的碳水化合物中乳糖含量≥90%。6歲以下低齡兒童患齲主要由于不良喂養(yǎng)習(xí)慣和（或）延長(zhǎng)的母乳或奶瓶喂養(yǎng)，其中不良喂養(yǎng)習(xí)慣包括：含奶瓶入睡、喂夜奶、延長(zhǎng)母乳或奶瓶喂養(yǎng)時(shí)間、過多飲用含糖飲料等[1]。由此可見配方奶是低齡兒童患齲的主要危險(xiǎn)因素之一。

赤蘚糖醇（erythritol）是一種新型糖醇類甜味劑，近年研究發(fā)現(xiàn)其還有防齲及抑制細(xì)菌的作用[2?9]。文獻(xiàn)報(bào)道主要集中研究赤蘚糖醇對(duì)鏈球菌屬及牙齦卟啉單胞菌的影響，赤蘚糖醇對(duì)口腔中主要致齲菌之一的乳桿菌生長(zhǎng)、產(chǎn)酸是否有影響尚少見報(bào)道。乳桿菌在流行病學(xué)中被稱為“齲標(biāo)志菌”[10]。

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）定量分析和比較乳桿菌的代表菌——嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，La）對(duì)不同濃度赤蘚糖醇?配方奶混合液中乳酸代謝量的影響，初步探討赤蘚糖醇在配方奶中抑制La產(chǎn)酸的能力，以期為進(jìn)一步研究和使用赤蘚糖醇預(yù)防奶瓶齲提供依據(jù)。

材料和方法

一

主要材料和儀器

La國際標(biāo)準(zhǔn)菌株（LaATCC4356，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)）；乳酸桿菌培養(yǎng)基（de Man， Rogosa and Sharp，MRS）肉湯、MRS培養(yǎng)基（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，雙蒸水按比例調(diào)配后121.1 ℃高壓滅菌）；赤蘚糖醇（分子式C4H10O4，相對(duì)分子質(zhì)量為122.12，保齡寶生物股份有限公司）；配方奶粉（“金智嬰”嬰幼兒配方奶粉，主要成分為蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、鈉等，香港明一營(yíng)養(yǎng)食品國際集團(tuán)股份有限公司）；無水乙醚（分析純，南京利盛化學(xué)試劑有限公司）；磷酸（分析純，阿拉丁，上海晶純生化科技股份有限公司），乳酸（80%分析純，阿拉丁，上海晶純生化科技股份有限公司）；磷酸二氫鉀（色譜純，KH2PO4，相對(duì)分子質(zhì)量136.09，阿拉丁，上海晶純生化科技股份有限公司）；甲醇（色譜純，西隴化工股份有限公司）；水相/有機(jī)相濾頭（13 mm，0.22 μm，上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；YQX?Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），超凈工作臺(tái)（SW?CJ?1FD 型，上海力申科學(xué)儀器有限公司），電子分析天平（Sartorius BS124S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），酶標(biāo)儀（Heraeu，德國），高效液相色譜儀（SHIMADZU，LC?20AP，日本），進(jìn)樣針（25 μl，HAMILTON，瑞士），色譜柱（UltimateTM XB?C18，4.6 mm×250 mm，5.0 μm，Welch，美國）。

二

實(shí)驗(yàn)方法

1

實(shí)驗(yàn)溶液的配備

①用雙蒸水配制1%、2%、4%、6%、8%的赤蘚糖醇溶液于200 ml錐形瓶中，121 ℃高壓滅菌15 min（赤蘚糖醇焦化溫度高于160 ℃）后迅速取出，按奶粉調(diào)配比例（150 g/L）加入奶粉（無菌操作臺(tái)操作），混勻，105 ℃高壓滅菌10 min，排氣取出，37 ℃培養(yǎng)12 h，再次105 ℃滅菌10 min，涂板培養(yǎng)無菌后冷藏備用。②稱取1.003 1 g乳酸（分析純），用雙蒸水定容于100 ml容量瓶中，取適量分別稀釋1、1.5、2、4、10、20、40、100倍，0.22 μm水相濾膜過濾，超聲振蕩除去氣泡。③配制0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液，用磷酸調(diào)pH值為2.8，0.22 μm水相濾膜抽濾，超聲振蕩40 min；甲醇0.22 μm有機(jī)相濾膜抽濾，超聲振蕩40 min。

2

La的分組培養(yǎng)及樣品制備

La常規(guī)復(fù)蘇48 h后接種于MRS肉湯，37 ℃厭氧（80%N2、10%CO2、10%H2）培養(yǎng)18 h，涂片檢查為純培養(yǎng)后，以3 000 r/min（離心半徑為9.3 cm）、4 ℃下離心15 min，棄上清液，磷酸鹽緩沖液重懸，紫外分光光度計(jì)調(diào)540 nm處的吸光度值為1.0。將上述菌液按120體積比分別接種于赤蘚糖醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%、4%、6%、8%的赤蘚糖醇（E）?配方奶（M）混合液（實(shí)驗(yàn)組）及不含赤蘚糖醇的配方奶溶液（對(duì)照組）中，并將實(shí)驗(yàn)組依次命名為1% E?M、2% E?M、4% E?M、6% E?M及8% E?M組；37 ℃厭氧（80%N2、10%CO2、10%H2）培養(yǎng)，于4、8、12、16、20及24 h分別取各培養(yǎng)液（每個(gè)濃度3個(gè)平行管每管3 ml），3 000 r/min（離心半徑為9.3 cm）、4 ℃離心15 min，取上清液，按11加入無水乙醚，用磷酸調(diào)pH值至2.0，3 000 r/min（離心半徑為9.3 cm）、4 ℃離心10 min，取上清液，0.22 μm有機(jī)相濾頭過濾，超聲振蕩去氣泡，4 ℃冷藏備用。

3

繪制乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

取各濃度系數(shù)的乳酸標(biāo)準(zhǔn)品10 μl進(jìn)樣于HPLC儀，記錄保留時(shí)間及峰面積。色譜柱為C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.02 mol/L磷酸二氫鉀（98%）：甲醇（2%）；流速為0.5 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為217 nm；柱溫30 ℃。以峰面積為Y軸，標(biāo)品質(zhì)量濃度（g/L）為X軸，繪制乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算其線性方程和相關(guān)系數(shù)R2。

4

樣品的檢測(cè)

取制備好的樣品各10 μl進(jìn)樣于高效液相色譜儀，檢測(cè)條件同上，根據(jù)保留時(shí)間確定乳酸的峰面積并記錄。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中乳酸的質(zhì)量濃度（g/L）。

三

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。對(duì)各組乳酸濃度進(jìn)行方差分析；對(duì)同一時(shí)間點(diǎn)不同組間及同組不同時(shí)間點(diǎn)間的兩兩比較采用Tukey HDS檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

結(jié)果

一

乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

見圖1，y=590 244x+67 507，R2=0.998 3。

二

乳酸的保留時(shí)間

乳酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖顯示，10 min前出現(xiàn)的峰代表溶液中的溶劑峰，11.297 min可見一獨(dú)立、對(duì)稱峰，代表溶液中的乳酸（圖2）；實(shí)驗(yàn)樣品色譜圖中，根據(jù)各濃度乳酸標(biāo)準(zhǔn)品中乳酸的保留時(shí)間，可確定樣品中保留時(shí)間為11.2 min左右的峰為乳酸的峰（圖3）。

三

各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組乳酸代謝濃度的比較

見表1。

1

各組乳酸濃度均值的比較

各組各時(shí)間點(diǎn)總體均值間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=187.448，P<0.05）；各組均值兩兩比較結(jié)果顯示，除4% p="">0.05），其余組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2

相同時(shí)間點(diǎn)各組乳酸濃度的比較

總體比較：同一時(shí)間點(diǎn)各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表1；兩兩比較：4 h時(shí)，對(duì)照組與各實(shí)驗(yàn)組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），各實(shí)驗(yàn)組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）； 8 h時(shí)，除1% E?M與2% E?M組、4% E?M組與6% E?M組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），其余組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；12 h時(shí)，4%、6%、8% E?M組與對(duì)照組及1% E?M組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；16 h與4 h時(shí)情況相同； 20 h時(shí)，對(duì)照組與1% E?M組，1%、2%及8% E?M三組間兩兩，4% E?M組分別與6%、8% E?M組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；24 p="">0.05），其余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3

同組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)乳酸濃度的比較

總體比較：同組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。兩兩比較：對(duì)照組、2% E?M組、8% E?M組同組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；1% 12="" 16="" p="">0.05），其他各時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）； 4="" 8="" 12="" 16="" p="">0.05），其余各時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

討論

赤蘚糖醇與其他糖醇類相比，具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：①低熱量值，能量值僅為0.84 kJ/g，是所有多元糖醇甜味劑中能量值最低的一種；②高耐受量、無毒副作用，進(jìn)入機(jī)體的赤蘚糖醇80%會(huì)迅速被小腸吸收，避免了腹瀉、腹脹等腸道不適；③吸濕性低[11?12]；④抗齲性[2?3]。本課題組前期研究顯示，赤蘚糖醇溶液可以抑制變形鏈球菌的生長(zhǎng)繁殖、產(chǎn)酸以及在菌斑形成過程中的黏附[5?9]。

牙菌斑內(nèi)細(xì)菌代謝產(chǎn)物中的糖在短時(shí)間內(nèi)可產(chǎn)生大量有機(jī)酸，使牙釉質(zhì)中的無機(jī)鹽溶解，這是齲病發(fā)生的直接原因。在流行病學(xué)中被稱為“齲標(biāo)志菌”的乳桿菌，其同型發(fā)酵菌種的代表菌有嗜酸乳桿菌，它們與齲病密切相關(guān)，且有很高的耐酸力[10]。Byun 等[13]和Chhour等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在成年患者齲病進(jìn)展部位乳桿菌數(shù)量明顯多于變形鏈球菌。La主要發(fā)酵產(chǎn)物為乳酸，副產(chǎn)物為丙酸、乙酸、丁酸、甲酸和微量的丙酮酸。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸、乙酸、丙酸均具有較高的致齲性，且在齲齒易感人群的牙菌斑生物膜中可檢測(cè)到較高濃度的乳酸[15]。近年來有研究證明，咀嚼木糖醇、山梨醇口香糖可減少牙菌斑中的乳桿菌數(shù)量[16]。但目前關(guān)于糖醇對(duì)乳桿菌作用的研究還較少。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)乳酸代謝量觀察赤蘚糖醇對(duì)La產(chǎn)酸的抑制性。

目前，有機(jī)酸的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法、離子色譜法和HPLC。HPLC是20世紀(jì)60年代中期得到迅速發(fā)展的一種分離、分析技術(shù)。適宜于揮發(fā)性低、相對(duì)分子質(zhì)量大的化合物或離子型化合物。具有使用范圍廣、分離效率高、速度快、準(zhǔn)確性及特異性高等特點(diǎn)[17]。HPLC技術(shù)目前已逐漸應(yīng)用于口腔醫(yī)學(xué)研究中，如Badet等[18]采用HPLC技術(shù)對(duì)木糖醇的酸性產(chǎn)物通過記錄培養(yǎng)基上pH值的變化判斷唾液中乳桿菌株對(duì)木糖醇的適應(yīng)性。

本項(xiàng)研究運(yùn)用HPLC對(duì)La在赤蘚糖醇?配方奶混合液和配方奶溶液中乳酸的代謝量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示加入赤蘚糖醇的配方奶溶液中乳酸代謝量顯著小于對(duì)照組；且高質(zhì)量分?jǐn)?shù)組（4%、6%、8%）乳酸代謝量顯著小于低質(zhì)量分?jǐn)?shù)組（1%、2%），即赤蘚糖醇對(duì)La在配方奶中產(chǎn)酸的抑制作用高質(zhì)量分?jǐn)?shù)組強(qiáng)于低質(zhì)量分?jǐn)?shù)組。這與本課題組前期研究赤蘚糖醇對(duì)變形鏈球菌作用的結(jié)果基本一致[5?9]。

La為乳桿菌中的同型發(fā)酵菌種，對(duì)糖的代謝類型為糖酵解途徑（embden meyerh of pathway， EMP）。EMP途徑是絕大多數(shù)生物的主流代謝途徑。葡萄糖分子經(jīng)細(xì)菌代謝后生成二分子丙酮酸，二分子NADH2和四分子腺苷三磷酸。同型發(fā)酵菌可以直接從EMP途徑的產(chǎn)物丙酮酸出發(fā)進(jìn)行同型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，并且經(jīng)過丙酮酸脫氫酶系進(jìn)入三羧酸循環(huán)，為菌體生長(zhǎng)提供足夠的能量及中間產(chǎn)物。

乳桿菌對(duì)糖醇的分解代謝不同于糖類,它們依靠一個(gè)具有底物特異性的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosph?ortransferase systems，PTS）將木糖醇、核糖醇（以及D?阿拉伯糖醇）主動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞，然后進(jìn)行磷酸化等系列生化反應(yīng)生成終產(chǎn)物乳酸、乙醇或乙酸[19]。關(guān)于木糖醇的防齲機(jī)制已有廣泛研究。木糖醇經(jīng)果糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞，磷酸化成為5?磷酸木糖醇并在細(xì)胞中形成積累，再經(jīng)脫磷酸成為木糖醇并被排出體外，這樣形成一個(gè)無效循環(huán)，從而對(duì)糖酵解形成競(jìng)爭(zhēng)抑制，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且可以抑制細(xì)菌發(fā)酵其他糖類[20?21]?？紤]赤蘚糖醇與木糖醇的同屬關(guān)系及在抑菌方面的相似性，推測(cè)赤蘚糖醇的抑菌產(chǎn)酸機(jī)制和木糖醇相似，即在糖醇進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)后被磷酸化，其產(chǎn)物抑制糖代謝所需酶的活性，進(jìn)而使其產(chǎn)酸力下降。但由于赤蘚糖醇為四碳糖（C4H10O4），有別于五碳糖的木糖醇（C5H12O5），所以其抑菌機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，赤蘚糖醇對(duì)La在配方奶中產(chǎn)酸有抑制作用，并且對(duì)嗜酸乳桿菌發(fā)酵配方奶中的多糖產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)抑制作用，加上赤蘚糖醇易吸收、耐受性高等特點(diǎn)，本項(xiàng)研究結(jié)果為其添加于配方奶粉中用于齲病預(yù)防提供了一個(gè)新的可能。

中英文摘要及參考文獻(xiàn)（略）

（收稿日期：2014-12-04）

（本文編輯：孔繁軍）