作者：哈爾濱市第五醫(yī)院口腔科（高振濤、李宗瑜、冉慶祥、唐臣）；杭州啟迪生物科技有限公司技術(shù)部（張澤宇）；首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室（崔磊）

近年研究發(fā)現(xiàn)，脂肪基質(zhì)中存在著一類具有多向分化潛能的成體間質(zhì)干細(xì)胞——脂肪干細(xì)胞（adipose derived stem cell，ADSC），在體外向成骨、軟骨、脂肪、肌肉等多個方向分化。脂肪干細(xì)胞體內(nèi)分布廣、分離培養(yǎng)操作簡單，較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞bone marrow derived mesenchymal stem cell，BMSC）具有更強(qiáng)的擴(kuò)增能力且無明顯的對血清批號的依賴性，因此ADSC具有更為重要的臨床應(yīng)用價值。本研究經(jīng)哈爾濱市第五醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核并批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：哈爾濱市第五醫(yī)院倫理委員會2012年1號），利用ADSC作為種子細(xì)胞誘導(dǎo)構(gòu)建的組織工程骨修復(fù)上頜骨缺損并種植義齒，現(xiàn)報告如下。

1.臨床資料：

患者女性，58歲，因交通事故致左上前牙缺失、牙槽突骨折合并骨缺損就診。檢查：顏面基本對稱，張口度正常，12缺失，牙齦組織完整，但缺牙區(qū)唇側(cè)牙槽突塌陷明顯、凸凹不平（圖1，2）。CT檢查示：12缺失，唇側(cè)牙槽骨缺失8.4 mm×1.0 mm×4.8 mm，并可見散在碎骨。診斷：上頜左側(cè)牙槽突骨折伴缺損、12缺失。將治療方案與患者及家屬充分溝通，知情同意后治療。

2.脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)：

患者腹部切取1.5 cm×1.5 cm×0.5 cm的皮下脂肪組織，生理鹽水沖洗后將脂肪抽吸獲得物以等體積磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗3遍，離心后吸出PBS，保留上層脂肪組織。加入0.075%的I型膠原酶，在37℃振蕩條件下消化60 min。以含10%胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Dulbecco’S modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)液終止消化。以1 200×g離心10 min，去上層液及脂肪，所獲得細(xì)胞以生長培養(yǎng)液重懸，接種于直徑100 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放人恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃、5%CO2、100%濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，至70%～80%融合狀態(tài)時以1：3的比例傳代擴(kuò)增細(xì)胞。傳至第3代時，用β-磷酸甘油鈉（10 nmol/L）、地塞米松（8~10 mol/L）、L-磷酸抗壞血酸（50μmol/L）、L-谷氨酰胺（300 mg/L）、二羥維生素D3（10 mmol/L）對細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。

3.組織工程骨體外構(gòu)建：

成骨誘導(dǎo)后的人ADSC以5×1010個/L的濃度接種于同種異體脫鈣骨（partially demineralized bone matrix，pDMB）（杭州啟迪生物科技有限公司）。支架大小為1 cm×2 cm×0.5 cm，支架孔隙率為75%±8%，平均孔徑（310±54）mm。按患者術(shù)前三維CT鏡像確定骨缺損的大小。體外培養(yǎng)3周，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞在脫鈣骨中生長情況。細(xì)胞以熒光染料DIO熒光標(biāo)記，將5μl DIO（Molecular Probes，美國）與1 ml DMEM混勻配制成染液，將細(xì)胞重懸于染液中，在37℃培養(yǎng)箱中靜置20 min，1 500 r/min離心5 min，棄去染液。接種于脫鈣骨，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞分布情況。

4.組織工程骨及種植體植入：

經(jīng)過3周培養(yǎng)出組織工程骨。局部麻醉下按外科常規(guī)手術(shù)方法暴露骨缺損區(qū)，刮除骨碎塊和肉芽組織，徹底止血，將工程骨用生理鹽水沖洗并修整使其與骨缺損區(qū)吻合后，把工程骨龕入缺損區(qū)使其邊緣和周圍正常骨密切接觸，見工程骨在缺損區(qū)穩(wěn)固后嚴(yán)密縫合軟組織封閉創(chuàng)面，術(shù)后應(yīng)用抗生素7 d。術(shù)后定期復(fù)查CT。植骨術(shù)后5個月，在12缺牙區(qū)植入直徑3.1 mm、長12 mm種植體（士卓曼，瑞士）1枚。

5.結(jié)果：

取自患者皮下脂肪組織的脂肪干細(xì)胞，體外生長情況良好，細(xì)胞呈長梭形（圖3A）。成骨誘導(dǎo)后，茜素紅染可見大量鈣結(jié)節(jié)形成（圖3B）。細(xì)胞經(jīng)DIO熒光染料標(biāo)記后，接種于脫鈣骨；3周后可見熒光標(biāo)記細(xì)胞均勻分布于孔壁（圖3C）。術(shù)后1、2、4個月CT顯示植骨區(qū)新生骨組織的改變區(qū)域逐漸擴(kuò)大，密度逐漸增高。植骨術(shù)后5個月植骨區(qū)牙槽骨外觀豐滿（圖4），植骨術(shù)后5個月植入種植體（圖5），種植術(shù)后1年種植體與骨組織愈合良好，修復(fù)完成（圖6）。組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，形成的組織工程化骨具有正常的骨小梁結(jié)構(gòu)，骨組織中間可見骨陷窩，骨小梁表面黏附活躍的成骨細(xì)胞（圖7）。

6.討論：

本病例采用的種子細(xì)胞是脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞，具有來源廣泛，取材方便，干細(xì)胞量大和易于分離純化的優(yōu)點(diǎn)。支架材料的異體脫鈣骨具有生物相容性和生物降解性，并保留了膠原支架的立體多孔狀結(jié)構(gòu)。同時脫鈣骨能為成骨細(xì)胞的生長、分化提供良好的基質(zhì)，并在修復(fù)骨缺損時有明顯的骨誘導(dǎo)作用。本病例牙間隙過小，因此只對12牙修復(fù)，匡未行修復(fù)，且到牙傾斜角大，與患者反復(fù)溝通將到磨改，烤瓷冠修復(fù)，患者不同意治療方案，雖然美觀性差但功能良好。本病例隨訪的時間尚短，需要長期隨訪。

來源：中華口腔醫(yī)學(xué)雜志