作者：李超1 王天祥2 鄒高峰1 柳宏志2

 [導讀] 在口腔種植領(lǐng)域中，由于各種原因造成的種植牙局部牙槽突骨量不足或種植體周圍骨缺損的修復在種植外科的研究中已經(jīng)取得了重大突破。

李超1  王天祥2  鄒高峰1 柳宏志2

（1黑龍江省佳木斯大學口腔醫(yī)學院  黑龍江佳木斯  154002）

（2黑龍江省大慶市油田總醫(yī)院口腔科  黑龍江大慶  163001）

       在口腔種植領(lǐng)域中，由于各種原因造成的種植牙局部牙槽突骨量不足或種植體周圍骨缺損的修復在種植外科的研究中已經(jīng)取得了重大突破。新一代的血漿提取物--濃縮生長因子（CGF，Concentrate Growth Factors）能夠明顯縮短術(shù)區(qū)成骨的時間，提高成骨質(zhì)量，促進成骨及組織的愈合。CGF是一種修補生物材料，其中含有濃縮生長因子及纖維蛋白，具有改善并增強組織再生的獨特性質(zhì)，是再生醫(yī)療領(lǐng)域中組織刺激的新技術(shù)。CGF技術(shù)是以患者自身靜脈血為原料，通過特殊的離心方法分離制備，再單獨或聯(lián)合其他生物材料注入硬組織缺損或軟組織創(chuàng)傷處，從而修補缺損，誘導生長，加速局部創(chuàng)傷的愈合并提高愈合質(zhì)量。

 1 、CGF技術(shù)的發(fā)展歷史

       1984年，Assoion[1]等發(fā)現(xiàn)了人血漿中提取的富血小板血漿(platelet—rich plasma，PRP)中含有多種生長因子，當PRP與氯化鈣以及牛凝血酶混合后，各種生長因子即從血小板中的α顆粒中釋放出來。但是牛凝血酶的使用往往伴隨著凝血因子Ⅴ、Ⅺ抗體的形成，并且存在著威脅生命的凝血紊亂發(fā)生的可能性[2]。作為第二代濃縮血小板，富血小板纖維蛋白（PRF）是由Choukroun首先引入的[3]。PRF是富纖維蛋白凝膠，由患者靜脈中抽取的新鮮血液制作而成，屬于新一代的血小板濃縮物，它制備簡單無需任何生物添加劑的處理。在PRF通過離心分離的制備過程中，血小板被激活同時大量脫顆粒細胞中蘊含的重要的生長因子釋放出來 [4]。濃縮生長因子(CGF)是Sacco首先研發(fā)的[5]，與PRF一樣，CGF由靜脈血分離制備而成。不過，兩項技術(shù)的離心速度有所不同。與PRF不同，CGF技術(shù)采用的速度從2400到2700rpm不等，這是為了分離靜脈血中的細胞，因此CGF中富含纖維蛋白凝塊比PRF中的大得多，而且更粘稠，纖維蛋白的含量也更多。使用富含纖維蛋白凝塊時，將顯示更強的再生力和更好的多樣性。CGF比PRF具有更高的抗張強度、更多的生長因子、更好的粘性和更高的粘合強度。因此，外科醫(yī)生可以將CGF作為隔膜來加速軟組織愈合或與骨移植物混合，以加快新骨重建。CGF無需添加任何化學或過敏性添加劑（例如凝血酶或抗凝劑），因此不會引起病毒性傳染病。

  2 、CGF的制備方法

       首先采集10ml患者的靜脈血，注入試管中，注滿后勿搖動，立即放入Medifuge（Silfradent 意大利）離心加速機的轉(zhuǎn)筒中。設(shè)定制備CGF程序，旋轉(zhuǎn)12分鐘后，可見試管中分為三層（最上層為血清，中間纖維蛋白層，底層為紅細胞及血小板），將血清分離出來，并存儲在特定的存儲器皿中。CGF被分離出來，并存儲在稀釋的抗菌溶液中（Lincocin 600mg）。底層的紅細胞部分及血小板立即存儲在器皿中，其中富含紅細胞、血小板以及鐵、鈣和其他基本元素、可以用來制備截骨術(shù)中的填料，以便混合生物材料及自體骨。將CGF切割成1-2mm的微粒，隨后依次與收集的紅細胞部分和骨代材料混合，為增加混合物的柔軟度，可添加一些血清。使用特定的收集設(shè)備（Silfradent 意大利）旋轉(zhuǎn)6秒鐘左右將其混合并攪勻，將這種密度大的糊狀粘結(jié)劑嵌入骨缺損處。另外CGF具有極大的可模制性，通過壓縮，這種凝結(jié)物可能表現(xiàn)為薄膜的形式，或是凝結(jié)物本身破碎而產(chǎn)生的碎片，通過用手術(shù)鉗壓制獲得CGF隔膜，然后在受損區(qū)域敷上CGF隔膜，由于隔膜具有一定的粘附力與彈性，使這些區(qū)域得以粘結(jié)愈合，手術(shù)結(jié)束時可以用少許血清來清洗傷口。

       3 、CGF的主要成分及生物學特性

       CGF作用的發(fā)揮有賴于其高濃度的各類生長因子及纖維蛋白原所形成的纖維網(wǎng)狀支架。制備CGF過程中特殊的變速離心使得血小板被激活，其中的血小板α顆粒釋放出各種生長因子，他們能促進細胞增殖、基質(zhì)合成和血管生成，而纖維網(wǎng)狀支架又能支持生長因子所誘導生成的新生組織。其中的濃縮生長因子包括血小板衍生生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)移生長因子-β(TGF-β)、類胰島素生長因子(IGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)以及成纖維細胞生長因子（FGF、骨形成蛋白(BMPs) 等。

他們各自作用分別為：

       (1)血小板衍生生長因子—PDGF是一種相對分子量大約為30kD的糖蛋白，首先在血小板的α顆粒中發(fā)現(xiàn)．也可由巨噬細胞、上皮細胞等合成和分泌，是最早出現(xiàn)在傷口的生長因子，可促進結(jié)締組織的修復和再生[6]。PDGF在血小板中有3種同分異構(gòu)體：PDGFαα、PDGFββ和PDGαβ，在人類主要以PDGFαβ雜二聚體存在。在機體遭受損傷時。PDGF從脫顆粒的血小板中釋放．激活其靶細胞(如巨噬細胞、成纖維細胞、骨髓干細胞等)的細胞膜受體，細胞漿內(nèi)的信號蛋白獲得高能磷酸鍵，信號蛋白活化后誘發(fā)一系列反應(yīng)。包括促進傷口處細胞的有絲分裂，形成功能性毛細血管．巨噬細胞發(fā)揮吞噬作用并釋放生長因子等。PDGF主要具有絲裂原作用，作為一種促有絲分裂因子，在損傷部位表達較高，促進細胞趨化、增殖，并且可增加膠原蛋白的合成能力[7]。

       (2)轉(zhuǎn)移生長因子-β(TGF-β) 有兩種形式，即TGF-β1和TGF-β2，相對分子量大約為25 kD。在血小板、巨噬細胞等內(nèi)合成。由血小板脫顆粒釋放或活化巨噬細胞分泌，以旁分泌形式作用于成纖維細胞、骨髓干細胞和前體成骨細胞。這些細胞又可合成和分泌TGF-β，以旁分泌或自分泌形式發(fā)揮作用[6]。因此，Marx等認為TGF-β是能支持長期組織愈合的骨再生因子。TGF的主要功能是促進前體成骨細胞趨化和有絲分裂。促使傷口處膠原基質(zhì)中的成骨細胞聚集。此外，TGF可以抑制破骨細胞形成和骨吸收，使得骨形成大于骨吸收。

       (3)類胰島素生長因子(IGF)是具有多種生理功能的生長因子，它對多種細胞具有促進有絲分裂的作用，包括成骨細胞、平滑肌細胞、骨骼肌細胞、角質(zhì)細胞等。作為促進細胞增殖的另一種表現(xiàn)，IGF可以抑制許多細胞在成熟之前的凋亡。此外，它還參與皮膚、骨骼和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和分化[8]。其作用機制是：IGF與細胞受體結(jié)合發(fā)生受體自身磷酸化，后激活酪氨酸蛋白酶。促使胰島素受體底物磷酸化，從而調(diào)節(jié)細胞的生長、發(fā)育和代謝。

       (4)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是1989年Ferrara等首先從牛垂體的濾泡狀細胞中純化的同源二聚體糖蛋白。其主要生理作用是：VEGF與受體結(jié)合后促進微血管周圍內(nèi)皮細胞的增殖、遷移，并改變其基因表達；增強血管通透性，促進血漿蛋白的滲出，形成富含纖維素并有利于新血管形成的細胞外基質(zhì)。在骨折部位存在氧梯度，在低氧狀態(tài)下，VEGF表達增高，促進成骨細胞的分化，提高堿性磷酸酶的表達，促進骨折愈合[9]。

       (5)表皮生長因子(EGF)是一種由53個氨基酸組成的低分子量單鏈多肽，具有多種生物學活性。其中以刺激體內(nèi)多種類型組織細胞分裂和增殖最為突出。此外，EGF能促進基質(zhì)合成和沉積。促進纖維組織形成[10]。

       (6)成纖維細胞生長因子（FGF）對骨再生和發(fā)育以及骨折的恢復起重要作用。他們的主要任務(wù)是誘導骨再生，而骨再生是骨組織形成過程中最重要的階段。

       7.BMPs（bonemorphogenetic proteins）：BMP是一種疏水性酸性多肽，與羥基磷灰石有較高的親和力，在諸多因子中唯一能夠單獨誘導骨組織異位成骨。這種活性蛋白使未分化的間充質(zhì)細胞化學趨化、聚集、定向分化為成骨細胞，合成膠原促進骨基質(zhì)形成，形成鈣化的骨組織。目前確定的已有20種BMPs，以BMP-2為中心，構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)化自身調(diào)節(jié)骨髓基質(zhì)干細胞的誘導成骨分化[11]。

       除了以上提到的這些生長因子外，CGF中還具有特殊的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)。采用Medifuge分相器進行精準的分離處理，通過纖維蛋白原分子(FG)的聚合作用，獲取的纖維蛋白塊可組成三維聚合物網(wǎng)絡(luò)，內(nèi)部纖維交織，均以凝膠狀態(tài)單相連接。在聚合過程中，纖維的直徑不斷增長，直至發(fā)生相互作用。纖維蛋白為富含彈性的有機纖維蛋白網(wǎng)格，纖維單體間的濃縮是三分子和多分子性的，這種纖薄，柔軟，彈性及可滲透的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使得骨細胞、紅細胞、白細胞、血小板及抗體易于增殖。CGF纖維蛋白分子結(jié)構(gòu)為三鍵式聯(lián)結(jié)，呈立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可有效的滯納血小板及各種循環(huán)分子（如細胞因子）。

       4 、小結(jié)與展望

       CGF可以促進血管有效增長，它使原有骨量的維持或重建成為可能，CGF可以加速移植的生物材料的融合與重整，幾乎不會引起任何感染。纖維蛋白能單獨引起血管新生，這一極其重要的特性可以通過纖維蛋白膠的三維結(jié)構(gòu)來解釋，此外還有困在其中的細胞因子的聯(lián)合作用，纖維蛋白原和纖維蛋白降解產(chǎn)物促進了中性粒細胞的遷移，增大了其表面上的受體CD11和CD18的容量，使中性粒細胞可以粘附內(nèi)皮細胞并游出，同時還可以使中性粒細胞粘附到纖維蛋白原上，這些要素還能形成噬菌作用和酶降解過程。纖維基質(zhì)能對上皮細胞和成纖維細胞起作用，從而引導受傷部位所覆蓋區(qū)域的愈合。所有這些因素使我們可以將CGF視作一個纖維蛋白凝結(jié)物，它能引起微脈管化，影響上皮細胞在其表面上的遷移。

       CGF應(yīng)用于損傷的組織時，通過引導損傷組織的再血管化，免疫調(diào)節(jié)以及捕獲循環(huán)血中的干細胞，最終促進組織愈合再生。在離心作用過程中，尤其是聚合階段，纖維蛋白膠凝塊的發(fā)育與生長使鏈結(jié)構(gòu)向各個方向膨脹。這樣，許多細胞成分被阻止，從而起到多種治療作用，例如：血漿和血小板細胞因子起到修復、消炎和止痛（TNF-a）的作用；血小板傳送信號，釋放各種生長因子，其中最重要的是PDGF、TGFβ-1和IGF-1，促進骨再生。因此，我們獲得體積較大、具有極強抵抗力的纖維蛋白膠凝塊，可將其用于牙洞填充物、膜支撐體、自體膜修復、與其他填充材料混合等一系列治療過程。

        CGF具有促進組織生長和愈合能力，有利于所有再生組織的恢復。由于CGF的特殊結(jié)構(gòu)，使得其具有極強的可模制性，因此在一定程度上可以代替GBR（引導骨再生技術(shù)）中的隔膜，但其在組織中的吸收時間以及隔離軟組織向骨缺損區(qū)內(nèi)部生長的確切機制還尚不明確，因此這也將是未來的一個研究方向。另外CGF技術(shù)在即刻種植、頜骨囊腫的治療、拔牙位點的保存、促進骨折愈合等領(lǐng)域也有著廣泛的研究前景。

參 考文 獻

[1] Assoian RIL Grotendorst GR Miller DM，et a1．Cellular transformation by coordinated action of three peptidegrowth factors from human platelet[J]．Nature，1984，309 (5971)：804—806．

[2] Carano RA, Filvaroff EH. Angiogenesisand bone repair[J].Discov Today.2003,8(21):980-989.

[3] Choukroun J, Adda F, Schoeffler C,Vervelle A. Une opportunite´ en paro-implantologie: le PRF[J]. Implantodontie 2001;42:55-62.French.

[4] Joseph Choukroun, MD,a Antoine Diss,DDS, MS,b Alain Simonpieri, DDS.Platelet-rich fibrin (PRF): A second-generationplatelet concentrate.PartⅠ:Technological concepts and evolution[J]. Oral Surg Oral Med OralPathol Oral Radiol Endod 2006;101:E33-44.

[5] Saccol L.Lecture,International academyof implant prosthesis and osteoconnection,2006.12.4.

[6]Marx RE，Carlson ER，Eichstaedt RM，et a1．Platelet-rich plasma：growth factor enhancement for bone grafts[J]．Oral Surg Oral Med Oral Pathol 0ral Radiol Endod， 1998，85 (6)：638-646．

來源：《中外健康文摘》2012年第17期供稿