朱宸佑   曹鈺彬   鄧佳   亓文婷   曹聰   石冰

口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華西口腔醫(yī)院唇腭裂外科（四川大學(xué)）成都 610041

[摘要]   膠原具有弱抗原性，良好的生物兼容性、生物降解能力以及生物力學(xué)性能，被廣泛用于皮膚、肌腱、血管、骨和神經(jīng)等部位的組織工程，而生長因子是生物體內(nèi)一類微量高效調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和組織修復(fù)的小分子物質(zhì)。膠原-生長因子生物材料（CGFB）在骨組織再生、神經(jīng)組織修復(fù)、肌腱重建和慢性傷口修復(fù)中表現(xiàn)出優(yōu)良的生物和生物力學(xué)性能。在骨組織修復(fù)中，CGFB合理地釋放生長因子，有效地誘導(dǎo)了干細(xì)胞成骨向分化和促進(jìn)受損骨組織修復(fù)。在神經(jīng)組織修復(fù)中，根據(jù)修復(fù)對象采用的特異性的CGFB膠原設(shè)計(jì)，有效地促進(jìn)了神經(jīng)突的生成。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)中，膠原凝膠的注入為細(xì)胞生長提供了良好的微環(huán)境，有利于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)。本文回溯CGFB的基本性質(zhì)及其近年來在骨和神經(jīng)修復(fù)領(lǐng)域中的研究進(jìn)展，以預(yù)測其未來可繼續(xù)改進(jìn)的方向。

[關(guān)鍵詞] 膠原；生長因子；組織工程；骨再生；神經(jīng)再生

口腔頜面部組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，血管神經(jīng)密集，無論外傷還是腫瘤切除等手術(shù)均易傷及軟硬組織和血管神經(jīng)，因而骨和神經(jīng)修復(fù)重建是口腔頜面外科最為重要的內(nèi)容，積極尋求新的技術(shù)手段和組織工程方法尤為重要和迫切[1-2]。本文就膠原-生長因子生物材料（collagen-growth factor biomaterial，CGFB）的研究進(jìn)展及其在骨和神經(jīng)組織再生中的應(yīng)用作一綜述，以便于口腔頜面外科同行了解與探索。

1  、膠原結(jié)合細(xì)胞因子生物材料

 膠原是一種細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）結(jié)構(gòu)蛋白，既是ECM的主要成分，也是人工模擬細(xì)胞環(huán)境時(shí)最常用的成分[3]。膠原分布于骨、軟骨、皮膚和肌腱等組織，具有弱抗原性，良好的生物兼容性、生物降解能力以及生物力學(xué)性能[4]，因而被廣泛用于皮膚、肌腱、血管、骨和神經(jīng)等部位的組織工程。由于膠原在不同的組織表現(xiàn)出質(zhì)量和類型有所差異，因此膠原在研究和實(shí)際應(yīng)用中都會(huì)因作用部分的不同而有所差別。

雖然膠原能為細(xì)胞生長提供適宜的環(huán)境，但僅僅如此卻不能滿足組織在短期內(nèi)快速再生的需求。生長因子對細(xì)胞新陳代謝和細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其級(jí)聯(lián)反應(yīng)起著重要的調(diào)控作用[5]。細(xì)胞因子通常由旁分泌或自分泌產(chǎn)生，且僅在局部起作用[6]；因此，體內(nèi)不同組織、不同時(shí)期產(chǎn)生的細(xì)胞因子種類和質(zhì)量差別較大，這為針對特定修復(fù)部位提供特定生長因子提供了依據(jù)和指導(dǎo)。在CGFB中，少量分散于膠原中的生長因子才是該生物材料功能的核心所在，故如何高效地釋放生長因子逐漸成為關(guān)注重點(diǎn)。

在眾多的細(xì)胞因子中，生長因子在組織再生和創(chuàng)傷修復(fù)領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用，譬如血管內(nèi)皮生長因子、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）、血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）等[7-15]。體內(nèi)細(xì)胞因子的釋放相當(dāng)復(fù)雜，某一局部涉及的細(xì)胞因子或生長因子豐富多樣，且按照特定時(shí)空順序進(jìn)行釋放；因此，針對某一局部，通常只選取相對作用最重要、質(zhì)量最豐富、最具有代表性和實(shí)際意義的生長因子進(jìn)行研究。隨著細(xì)胞環(huán)境模擬度的提高，多種細(xì)胞生長因子按照一定的比例協(xié)同促進(jìn)組織生長[16-17]。

近年來，CGFB在組織工程中發(fā)揮著越來越重要的作用，譬如，血管再生對大多數(shù)組織都至關(guān)重要，ECM膠原整合的bFGF和EGF對血管生成有改善或提升效果[18]，故這兩種生長因子對于大多數(shù)組織的再生都有積極的促進(jìn)作用。此外，由成纖維細(xì)胞主導(dǎo)的ECM的合成和分泌在組織工程修復(fù)過程也是必要的，而PDGF有利于成纖維細(xì)胞的擴(kuò)張和遷移[19]。由此觀之，與CGFB有關(guān)的基礎(chǔ)研究可為其決策提供選擇方向和依據(jù)，但因?yàn)榧?xì)胞生長因子作用的復(fù)雜性，故還需要根據(jù)具體組織判斷選擇。雖然CGFB在肌肉、皮膚和黏膜中也有相當(dāng)重要的作用[17, 20-24]，但本文只介紹CGFB在骨和神經(jīng)修復(fù)中的作用及其相應(yīng)的改良措施。

2 、CGFB在骨組織修復(fù)中的應(yīng)用

骨組織修復(fù)是組織工程研究的一個(gè)重要領(lǐng)域，CGFB作為一個(gè)極具前景的生物材料已經(jīng)投入了市場；然而，傳統(tǒng)的CGFB的成骨效果受到膠原和細(xì)胞因子自身的限制，并不令人滿意，細(xì)胞生長因子在膠原中如何更加高效地釋放也在很大程度上限制了CGFB的應(yīng)用。近年來為了進(jìn)一步提升CGFB在骨組織修復(fù)中的效果，不同的試驗(yàn)室分別從膠原性質(zhì)、生長因子性質(zhì)以及兩者的結(jié)合等方面對材料作了改進(jìn)。CGFB能在骨組織修復(fù)中表現(xiàn)出值得期待的促組織修復(fù)效果，在于合理地使用和釋放了細(xì)胞因子。BMP是一類僅在骨和軟骨再生中使用的生長因子，可有效地誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨向分化和促進(jìn)受損骨組織修復(fù)。研究[25]顯示，將BMP分散在膠原中使其隨膠原的生物降解釋出，由于膠原與BMP之間的結(jié)合疏松，因此材料在移植到體內(nèi)的初期會(huì)產(chǎn)生近30%的爆發(fā)性釋放，這既導(dǎo)致藥物的浪費(fèi)，還可能因藥物過量對患者造成傷害。此外臨床上尚在使用的基本CGFB模型的釋放效果并不令人滿意，于是不斷有研究者[26]試圖從細(xì)胞生長因子運(yùn)載方式上改良原有模型。譬如，Lee等[27]將搭載低劑量的BMP-2納米纖維置于膠原內(nèi)部，很好地模擬了ECM的天然結(jié)構(gòu)，達(dá)到了緩釋和擴(kuò)大BMP-2骨再生效應(yīng)的目的。根據(jù)該研究結(jié)果推斷，由納米顆粒和納米纖維等組成單一或多級(jí)的緩釋模型均可應(yīng)用于骨組織修復(fù)；另外，構(gòu)建復(fù)雜的三維仿生模型，也可能有利骨組織修復(fù)。

相對于細(xì)胞生長因子而言，CGFB的生物力學(xué)性能對于骨修復(fù)效果的影響不明顯，相關(guān)研究較少。基質(zhì)是否適合骨細(xì)胞的增殖、生長、遷移和分化也是值得考慮的，而材料自身硬度是一個(gè)重要因素[28]。Banks等[29]在通過交聯(lián)的方法在不改變膠原孔徑前提下獨(dú)立控制硫酸軟骨素膠原材料硬度，觀察脂肪間質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，較硬的基質(zhì)會(huì)無視生長因子的存在而誘導(dǎo)成骨基因表達(dá)，而較軟的基質(zhì)則需要生長因子才能誘導(dǎo)成骨基因表達(dá)。這一研究結(jié)果對于成骨研究領(lǐng)域選擇CGFB硬度有著重要的指導(dǎo)意義，根據(jù)對誘導(dǎo)成骨的要求，可以選擇不同硬度的材料和決定是否選用生長因子。

Yamano等[30]在體內(nèi)外試驗(yàn)中分別從膠原膜中緩釋PDGF和生長分化因子（growth differation factor，GDF）-5發(fā)現(xiàn)，GDF-5更能提高成骨細(xì)胞的增殖活性和成骨基因表達(dá)，從而加速骨再生。在不斷尋找和選擇天然存在的更適于治療的細(xì)胞因子的同時(shí)，人工合成的新細(xì)胞因子也正在研究中。Kleinschmidt等[31]將BMP-2殘基引入GDF-5中產(chǎn)生了基因突變的蛋白BB-1。BMP-2對于需要血管再生的長骨重建效果并不好，BB-1則結(jié)合了BMP-2和GDF-5的優(yōu)點(diǎn)[32]，同時(shí)促進(jìn)了骨再生和血管再生。沿此思路，可以不斷地通過化學(xué)合成的方法制造和確認(rèn)更優(yōu)的成骨細(xì)胞因子，以提高骨組織修復(fù)效果。

       骨組織重建作為CGFB在組織工程應(yīng)用的典型方向，存在著組織工程普遍存在的一些問題：釋放系統(tǒng)不足，大小骨組織損傷修復(fù)要求有所區(qū)別等。近期的研究主要集中在細(xì)胞因子釋放問題上，而對于生物力學(xué)性能和細(xì)胞因子的選擇研究較少。學(xué)術(shù)界一方面在生物力學(xué)性能和細(xì)胞因子的問題上已經(jīng)達(dá)成了一致的共識(shí)，一方面未來可能緣于釋放模型的需要會(huì)結(jié)合生物力學(xué)性能精確控制，也可能因傳統(tǒng)細(xì)胞因子平庸而啟動(dòng)新細(xì)胞因子合成研究。CGFB在骨修復(fù)和骨重建研究富有臨床意義，也為今后研究提供了思路和依據(jù)。

3 、CGFB在神經(jīng)組織修復(fù)中的應(yīng)用

     神經(jīng)修復(fù)是組織工程的另一重要領(lǐng)域，但由于神經(jīng)細(xì)胞高分化，故神經(jīng)修復(fù)要較骨重建困難一些。此外，中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)功能上有著巨大差別，由于這些差異性和復(fù)雜性，所以CGFB在神經(jīng)修復(fù)中的研究側(cè)重點(diǎn)完全不同于前文提到的骨組織修復(fù)。CGFB在神經(jīng)修復(fù)中根據(jù)修復(fù)對象采用了不同膠原設(shè)計(jì)。

在神經(jīng)修復(fù)中，神經(jīng)細(xì)胞能否有效增殖和遷移相當(dāng)重要。過去，細(xì)胞通常培養(yǎng)于二維環(huán)境中，不能很好地模擬細(xì)胞增殖和遷移的環(huán)境，于是細(xì)胞環(huán)境的設(shè)計(jì)開始受到重視，開始出現(xiàn)三維環(huán)境的設(shè)計(jì)[15,33]。Labour等[34]設(shè)計(jì)了一種由高純度ECM構(gòu)成，較普通培養(yǎng)基厚，膠原密度和多孔性以及纖維大小適合神經(jīng)細(xì)胞生長的三維培養(yǎng)基，并加入適量NGF和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因。該精心設(shè)計(jì)的仿生三維膠原基質(zhì)，可有效地促進(jìn)神經(jīng)突的生成，而神經(jīng)突的生成對于周圍神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)非常重要。正如前文提到的骨緩釋系統(tǒng)設(shè)計(jì)，神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境設(shè)計(jì)也模仿了天然ECM的成分和結(jié)構(gòu)，可見這種仿生思路能有效應(yīng)用于多種領(lǐng)域，而三維環(huán)境的設(shè)計(jì)在針對神經(jīng)突的周圍神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)中也很有發(fā)展前景。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)中，凝膠態(tài)膠原也能為神經(jīng)細(xì)胞的生長提供良好的環(huán)境。過去直接將細(xì)胞移植到特定部分，細(xì)胞因缺少適宜穩(wěn)定的微環(huán)境，其生長和增殖受到抑制，治療效果常常難盡如人意，而膠原凝膠的注入能為細(xì)胞提供了良好的微環(huán)境。Egawa等[35]將神經(jīng)干細(xì)胞置于結(jié)合了EGF的膠原凝膠中，干細(xì)胞明顯增殖且成功分化為多種神經(jīng)細(xì)胞亞群。Macaya等[36]發(fā)現(xiàn)，結(jié)合有成纖維細(xì)胞生長因子-2膠原水凝膠的星形膠質(zhì)細(xì)胞能有效滲入凝膠并遷移到移植體部位。由此可見，膠原凝膠適宜的環(huán)境，神經(jīng)細(xì)胞能有效地增殖、分化和遷移，從而有利于神經(jīng)修復(fù)進(jìn)行，有望應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的臨床修復(fù)。

神經(jīng)修復(fù)還可能需要特殊基質(zhì)形態(tài)來滿足修復(fù)的要求，這可能是神經(jīng)修復(fù)與其他組織最大的區(qū)別。在周圍神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)中，鑒于神經(jīng)軸突的特殊形態(tài)，通常會(huì)采用與其形態(tài)相符合的神經(jīng)導(dǎo)管。神經(jīng)導(dǎo)管的基本作用是為損傷神經(jīng)末端創(chuàng)造一個(gè)能再生、通過和連接的穩(wěn)定環(huán)境。神經(jīng)缺損的距離越長，修復(fù)難度越大，為了延長修復(fù)距離，有研究[37]將細(xì)胞因子刺激與導(dǎo)管膠原支架結(jié)合起來，希望能促進(jìn)神經(jīng)斷端重新接合。Cui等[38]將結(jié)合了睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子和bFGF的膠原支架連接到微型豬缺損長度達(dá)35 mm的神經(jīng)間隙近端和遠(yuǎn)端之間，成功誘導(dǎo)了長距離神經(jīng)再生。該研究證明了短距離修復(fù)可應(yīng)用于長距離修復(fù)[39]。

CGFB在神經(jīng)組織修復(fù)的研究范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如骨組織修復(fù)多樣，或者說還處于一個(gè)相對初級(jí)的階段，這可能緣于修復(fù)本身的復(fù)雜性和神經(jīng)組織的多樣性。到目前為止，只側(cè)重于有利的修復(fù)環(huán)境的設(shè)計(jì)，至于生長因子的選擇，基本上是一些常用的細(xì)胞因子和一些神經(jīng)營養(yǎng)因子，顯得針對性不強(qiáng)；但是，神經(jīng)組織的修復(fù)不僅需關(guān)注神經(jīng)修復(fù)環(huán)境的問題，神經(jīng)系統(tǒng)不同部分、不同細(xì)胞的差異性也是需關(guān)注的重點(diǎn)，因此，修復(fù)的研究也逐漸走向具體和精細(xì)化的方向。人們有理由相信，CGFB在神經(jīng)組織重建方面還會(huì)有更多精細(xì)化的環(huán)境設(shè)計(jì)，同時(shí)也期待更多突破現(xiàn)有瓶頸的研究成果出現(xiàn)。

4   參考文獻(xiàn)（略）

本文發(fā)表于《國際口腔醫(yī)學(xué)雜志》2016年43卷第6期：729-733.

來源：國際口腔醫(yī)學(xué)雜志