來源：《華西口腔醫(yī)學(xué)雜志》2018年4月第36卷第2期

作者：孫同正1 滕飛2,3 賈松菠1 唐永平1 姜明1 黃適2 袁曉1 李曉嵐3 楊芳1,3

作者單位：1.青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，青島 266071；2.中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，青島 266100；

3.中山大學(xué)廣東省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510055

[摘要]  目的  通過高通量測(cè)序技術(shù)研究重癥低齡兒童齲病和健康者唾液的菌群結(jié)構(gòu)及其差異。方法  在青島市嶗山區(qū)兒童中，經(jīng)口腔檢查選取健康（H組）和重癥低齡齲?。–組）兒童各24名，采取唾液樣本，提取其DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，利用454測(cè)序平臺(tái)對(duì)16S rRNA V1—V3區(qū)進(jìn)行雙端測(cè)序，對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行差異分析。結(jié)果  C組唾液菌群物種豐度高于H組（P<0.05），兩組唾液菌群結(jié)構(gòu)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且C組的群落結(jié)構(gòu)更為相似和保守（P<0.001）；鑒別出C組高表達(dá)的可疑致齲微生物（P<0.1）及H組高表達(dá)的健康相關(guān)微生物（P<0.1）；基于唾液菌屬圖譜建立的齲病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型區(qū)分健康和齲病者的準(zhǔn)確率可高達(dá)70%以上。結(jié)論  唾液菌群和特定細(xì)菌種類，如比例升高的Prevotella菌屬有助于評(píng)估和篩選低齡兒童齲病風(fēng)險(xiǎn)。

[關(guān)鍵詞]  低齡兒童齲； 口腔菌群； 唾液； 元基因組學(xué)

開 篇

     齲病是發(fā)生在牙齒的慢性感染性疾病，其中低齡兒童齲（early childhood caries，ECC）是影響兒童口腔健康的最主要的慢性疾病之一[1]。ECC不僅影響兒童期口腔健康，還可以引發(fā)一系列的感染和疼痛，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2-3]。世界衛(wèi)生組織對(duì)186個(gè)國(guó)家的人群口腔健康進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)20年的縱向調(diào)查，結(jié)果顯示：在大部分國(guó)家，齲病仍影響著60%~90%的學(xué)齡兒童[4]。因此，針對(duì)齲病的病因?qū)W研究、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估乃至預(yù)防策略都是當(dāng)今研究的重點(diǎn)問題[5]。

    人類與其體內(nèi)共生的微生物（即共生菌群，亦稱人體微生物組）共同組成一個(gè)超級(jí)生物體，而口腔的健康與疾病狀態(tài)依賴于宿主與口腔微生物群落之間的相互作用[6]。齲病四聯(lián)因素學(xué)說認(rèn)為，細(xì)菌、環(huán)境、宿主、時(shí)間均是齲病發(fā)生的必要條件，細(xì)菌是其中一項(xiàng)重要環(huán)節(jié)。2000年以來，獲得越來越多學(xué)者認(rèn)同的“生態(tài)菌斑假說”[7]亦為齲病的微生物病因?qū)W研究提供了新切入點(diǎn)?？谇痪菏侨梭w內(nèi)最復(fù)雜的微生物群落之一，其中絕大多數(shù)微生物不可培養(yǎng)[8]。由于技術(shù)手段和分析策略的局限性，極大地限制了對(duì)齲病根源進(jìn)行全面而精準(zhǔn)地解析。近年來，人類微生物組學(xué)計(jì)劃的深入開展和高通量測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展為口腔菌群研究提供了前所未有的嶄新視野，同時(shí)為齲病的微生物病因?qū)W的深入認(rèn)知帶來了新契機(jī)。

    本研究采用新一代的高通量生物技術(shù)（454 GS FLX Titanium）并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析手段，旨在全面解析口腔唾液微生物群落的生態(tài)特征，并對(duì)重癥低齡齲兒童及健康兒童的唾液菌群進(jìn)行相互比較分析，探討可能的參與齲病發(fā)生發(fā)展的微生物因素。

1   材料和方法

1.1  樣本采集

1.1.1  采樣對(duì)象的選擇  2016年4—5月對(duì)青島市嶗山區(qū)幼兒園兒童進(jìn)行口腔檢查，篩選出24名重癥低齡兒童齲（severe early childhood caries，S-ECC）兒童（C組）和24名健康兒童（H組）參與本研究。C組兒童要求齲失補(bǔ)牙指數(shù)（decayed, missing, and filled teeth，dmft）≥10，H組要求dmft=0；兩組兒童年齡均在4歲左右，其中男24名（健康和疾病人數(shù)的比例為1∶1），女24名（健康和疾病人數(shù)的比例為1∶1）。所有兒童要求檢查前1個(gè)月未服用抗生素，口唇黏膜顏色、質(zhì)地均未見異常，沒有發(fā)育畸形及全身性疾病等先天疾病，近1個(gè)月內(nèi)未佩戴口腔活動(dòng)矯治器。整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程各項(xiàng)細(xì)節(jié)及以后的數(shù)據(jù)發(fā)表均得到青島大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，同時(shí)征得兒童監(jiān)護(hù)人同意。

1.1.2  樣本采集方法  口腔檢查：由兩名牙體牙髓專科醫(yī)生以視診結(jié)合探診的方式進(jìn)行檢查，檢查器械均經(jīng)高溫高壓嚴(yán)格滅菌消毒。在檢查前統(tǒng)一認(rèn)識(shí)、方法和標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)一致性檢驗(yàn)的Kappa值均大于0.83。采用世界衛(wèi)生組織《口腔健康調(diào)查基本方法》（1997年）對(duì)齲病的診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷齲病。

    唾液收集：篩選進(jìn)入研究的兒童取樣前一晚及當(dāng)天早晨不刷牙，上午9時(shí)進(jìn)行樣本收集。取樣時(shí)，囑兒童把自然、未受刺激的唾液緩慢吐入無菌50 mL離心管中，持續(xù)5 min，對(duì)樣品分別編號(hào)，封口至4 ℃采樣樣品保存箱，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2  基因組DNA提取、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增及測(cè)序

    采用DNeasy® Blood and Tissue kit（Qiagen公司，美國(guó)）試劑盒純分離樣本中基因組DNA，定量測(cè)定其濃度，檢測(cè)純度，并電泳檢測(cè)DNA完整性，保存于-80 ℃。選取16SrRNA片段上V1—V3高變區(qū)（Escherichia coli positions 5—534）作為擴(kuò)增目標(biāo)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按照Qiagen MiniElute試劑盒提供的操作流程進(jìn)行回收并純化目的片段DNA，溶解于20 μLTE液洗滌[9]，利用454 GS FLX Titanium平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.3  數(shù)據(jù)分析

    利用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的454高通量序列處理流程，利用MOTHUR（https://www.mothur.org/）軟件對(duì)得到的原始序列進(jìn)行質(zhì)量控制[9]。

1.3.1  群落結(jié)構(gòu)分析  基于操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）結(jié)果計(jì)算物種豐度估計(jì)指數(shù)（Chao1）及物種多樣性指數(shù)（Shannon和Simpson），以展示口腔唾液菌群的α多樣性。通過計(jì)算任意兩個(gè)樣品的Bray-Curtis距離，構(gòu)建Bray-Curtis矩陣并進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA），以展示C組和H組間的物種結(jié)構(gòu)特征（β多樣性）。

1.3.2  物種的種系發(fā)育信息分析  從門到種水平進(jìn)行細(xì)菌種系信息劃歸。利用RDP Classifier分類工具，比對(duì)Greengens數(shù)據(jù)庫(kù)（http://greengenes.secondgenome.com/），選取置信度0.8為臨界閾值，低于該臨界值即列為未分類細(xì)菌，并計(jì)算每個(gè)門類各物種的相對(duì)豐度。

1.3.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析  所有統(tǒng)計(jì)分析采用R（Version 3.2.1）軟件包進(jìn)行。兩組間比較采用Wilcoxon ranksum檢驗(yàn)，多重比較采用Bonferroni檢驗(yàn)校正（P<0.1認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。采用多因素方差分析（permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA）檢測(cè)疾病狀態(tài)和性別對(duì)菌群結(jié)構(gòu)的影響程度。所用模型算法為機(jī)械學(xué)習(xí)的隨機(jī)森林（random forest，RF）法，預(yù)測(cè)能力通過受試者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）分析，模型區(qū)分能力則利用ROC曲線評(píng)估（area under the curve，AUC）進(jìn)行分析。

2   結(jié)果

    采用多樣本平行標(biāo)記技術(shù)對(duì)兒童口腔唾液樣品進(jìn)行分析，得到約400 bp長(zhǎng)的序列。經(jīng)初步篩選，共獲得270 395條序列，每個(gè)樣品平均得到5 634條序列。

2.1  基于OTU的菌種多樣性分析

    由圖1可見：H組與C組的Shannon和Simpson指數(shù)無明顯差異（P>0.05），但兩組的Chao1指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且C組明顯高于H組（P<0.05）；不同性別的α多樣性指數(shù)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2  基于Bray-Curtis的群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

    H組和C組唾液微生物群落結(jié)構(gòu)見圖2。首先，齲病狀態(tài)會(huì)顯著影響唾液菌群結(jié)構(gòu)（F=2.76，P<0.01），而性別對(duì)唾液菌群結(jié)構(gòu)沒有明顯影響（P>0.05，圖2左）；其次，H組和C組的菌群結(jié)構(gòu)存在差異（P<0.01），且C組兒童的群落結(jié)構(gòu)更為相似和保守，而H組則相距較遠(yuǎn)且更為分散（P<0.001，圖2中）；最后，進(jìn)一步通過距離矩陣進(jìn)行PCoA分析，可以在P1主坐標(biāo)看到兩組人群的分離趨向（P<0.01，圖2右）。

2.3  基于種系發(fā)育信息的群落特點(diǎn)

    對(duì)H組和C組唾液的菌群微生物相對(duì)豐度進(jìn)行比較分析，結(jié)果見圖3。在細(xì)菌門水平，兩組樣品的組成成分都較為近似，超過99%的群落成員由以下6個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門構(gòu)成，包括厚壁菌門（Firmicutes，42.55%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，24.50%）、變形菌門（Proteobacteria，16.76%）、放線菌門（Actinobacteria，9.51%）、梭桿菌門（Fusobacteria，4.94%）、TM7（1.18%）；但H組和C組在門水平上的物種組成無明顯差異。

 在門、綱、目、科、屬、種6個(gè)分類水平，分別對(duì)不同性別來源和不同疾病狀態(tài)的人群進(jìn)行比較，未發(fā)現(xiàn)性別相關(guān)的細(xì)菌種類；在H和C組間比較，未發(fā)現(xiàn)齲特異性細(xì)菌種類（單獨(dú)存在于某一方人群，而另一方人群中缺失），但從綱到屬4級(jí)水平均檢測(cè)到相對(duì)豐度存在顯著差別分布的細(xì)菌種類（圖4）。

  由圖4可以總結(jié)出兩組高表達(dá)的微生物。1）C組高表達(dá)的微生物，即可疑致齲微生物（P<0.1）：擬桿菌綱（Bacteroides）、擬桿菌目（Bacteroidales）

、普氏菌科（Prevotellaceae）以及普氏菌屬（Prevotella）；2）H組高表達(dá)的微生物，即健康相關(guān)微生物（P<0.1）：黃桿菌綱（Flavobacteria）、黃桿菌目（Flavobacteriales）、黃桿菌科（Flavobacteriaceae）、棒狀桿菌科（Corynebacteriaceae）、伯杰菌屬（Bergeyella）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）和鏈球菌組（Streptococcaceae Group）。

2.4  利用唾液菌群建立S-ECC兒童齲病的評(píng)估模型

    基于S-ECC兒童齲病時(shí)口腔菌群表現(xiàn)出明顯改變的結(jié)果，筆者利用RF法基于唾液菌群種系發(fā)育屬水平上的全部物種以及篩選出來的4個(gè)潛在的齲病生物標(biāo)記物 （Prevotella、Bergeyella、Corynebacterium、Streptococcaceae Group）建立評(píng)估模型，結(jié)果見圖5。由圖5可見，基于所有唾液細(xì)菌屬信息建立的齲病評(píng)估模型（圖5左，AUC=0.88，準(zhǔn)確率為0.79）區(qū)分健康和齲病的性能略優(yōu)于基于4個(gè)細(xì)菌屬信息建立的評(píng)估模型（圖5右，AUC=0.78，準(zhǔn)確率為0.73），提示該細(xì)菌屬作為低齡兒童齲病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型具有應(yīng)用潛能。

 3  討論

    首先，本研究考察了S-ECC兒童和健康兒童的唾液菌群物種多樣性差異，發(fā)現(xiàn)兩組的物種多樣性指數(shù)Shannon和Simpson均無差異，這與之前的研究結(jié)果一致[10-12]；但C組的唾液菌群物種豐富度（Chao1指數(shù)）顯著高于H組，提示口腔的齲病狀態(tài)與唾液微生物的物種豐富度存在一定關(guān)系，但其原因還有待后續(xù)進(jìn)一步驗(yàn)證。

    其次，通過考察健康組和齲病組的唾液菌群結(jié)構(gòu)差異，發(fā)現(xiàn)齲病狀態(tài)是影響菌群結(jié)構(gòu)變異的最重要因素，且H組和C組菌群結(jié)構(gòu)具有明顯區(qū)分性，說明齲病的發(fā)生并不是某種特異性微生物的作用結(jié)果，而是口腔生物膜菌群結(jié)構(gòu)整體發(fā)生的改變，這亦與“生態(tài)菌斑假說”的理論相一致[7]。特別的是，H組樣本彼此間變異較大，而C組樣本間唾液菌群相對(duì)保守度高，這提示齲病的發(fā)生模式可能較為一致。值得注意的是，既往的兒童齲病縱向研究[9]和成年人齲活躍者元基因組學(xué)研究中[6]亦發(fā)現(xiàn)健康和齲病者菌群結(jié)構(gòu)上存在顯著差異，但在低齡兒童齲病的橫斷面研究[10-12]中較難檢測(cè)到。本研究發(fā)現(xiàn)差異的可能原因是研究對(duì)象均為重癥齲病者（dmft≥10），兩組的口腔健康狀態(tài)表型差異較大，且采用了較為靈敏的多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。這一結(jié)果提示，當(dāng)無法進(jìn)行縱向?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)剔除個(gè)體背景干擾因素時(shí)，選取疾病狀態(tài)較為嚴(yán)重的極端樣本可較易挖掘疾病發(fā)生的一定內(nèi)部規(guī)律。

    然后，對(duì)于種系發(fā)育信息的結(jié)果，本研究得出的主要細(xì)菌門構(gòu)成與既往關(guān)于兒童口腔牙菌斑的研究[10-11,13]相互驗(yàn)證，但在兩組人群中無明顯差異。本研究未發(fā)現(xiàn)有該類“齲特異性”細(xì)菌存在，但觀察到在兩組人群中豐度存在顯著差異的“齲相關(guān)性”細(xì)菌種類。在細(xì)菌屬水平，S-ECC者檢測(cè)到顯著增加的（增加約7%豐度）Prevotella屬，且發(fā)現(xiàn)此屬的更高級(jí)分類亦在S-ECC組中高表達(dá)，包括綱水平上的Bacteroides，目水平上的Bacteroidales，科水平上的Prevotellaceae。Prevotella為無芽孢革蘭陰性厭氧桿菌，體外培養(yǎng)時(shí)缺乏致齲相關(guān)的產(chǎn)酸特性，僅具備中度耐酸能力[14]，并非常規(guī)意義上講的致齲性較強(qiáng)的細(xì)菌，如Streptococci mutans或Lactobacilli等[15]；但是其他一系列依賴相同或者不同技術(shù)手段的齲病菌群研究[9,16-17]也有類似結(jié)果，即發(fā)現(xiàn)Prevotella與齲病關(guān)系密切。Simón-Soro等[18]發(fā)現(xiàn)，在牙本質(zhì)齲樣品中膠原酶過量表達(dá)，而該基因主要來源于升高的Prevotella屬，提示Prevotella可能并非通過傳統(tǒng)的致齲特性（產(chǎn)酸、耐酸等）參與了牙體組織脫礦而誘發(fā)齲病，而是潛在性地通過自身的蛋白溶解特性參與了齲病發(fā)展這一過程。

    最后，齲病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估已經(jīng)成為了當(dāng)今齲病研究的一個(gè)重點(diǎn)問題，也是現(xiàn)代齲病防治的重要組成部分[5]。本研究基于唾液菌群細(xì)菌屬和篩選的4個(gè)菌屬，分別建立了齲病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型，區(qū)分健康和齲病樣品的準(zhǔn)確率均可以達(dá)到70%以上；特別是基于篩選的4個(gè)微生物因子的齲病評(píng)估模型與基于全菌譜的齲病評(píng)估模型性能較為相似，這一結(jié)果提示可以利用這4個(gè)菌屬建立快速、準(zhǔn)確而便捷的齲病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法。

[參考文獻(xiàn)]（略）

詳見《華西口腔醫(yī)學(xué)雜志》2018年4月第36卷第2期