來源：《華西口腔醫(yī)學(xué)雜志》2016年6月第34卷第3期

作者：茍?jiān)娙?/span>^1,2  張帆¹  李萌婷¹  黃婷¹  鄭立舸（通信作者）^1,2

作者單位：1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，瀘州 646000；2.口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室  華西口腔醫(yī)院（四川大學(xué)），成都 610041

[摘要] 目的  探討在鈦表面制備羥磷灰石（HA）/殼聚糖（CS）-轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）緩釋微球復(fù)合涂層及其對(duì)成骨細(xì)胞黏附與增殖的影響。方法  通過物理-化學(xué)-生物改性聯(lián)合方式制備HA/CS-TGF-β1緩釋微球復(fù)合涂層。運(yùn)用掃描電鏡（SEM）、X射線衍射儀（XRD）、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）等分析涂層的形貌和物相；使用CCK-8及免疫熒光檢測其對(duì)成骨細(xì)胞的細(xì)胞毒性及細(xì)胞黏附和增殖的影響。結(jié)果  成功制備HA/CS-TGF-β1緩釋微球復(fù)合涂層，該涂層制備具有超親水性，體外釋藥穩(wěn)定且時(shí)間長，成骨細(xì)胞在此復(fù)合涂層的鈦片上生長無抑制，且對(duì)細(xì)胞的黏附與增殖具有促進(jìn)作用。結(jié)論  HA/CS-TGF-β1緩釋微球復(fù)合涂層在體外對(duì)于成骨細(xì)胞的黏附與早期增殖有明顯的促進(jìn)作用，具有良好的運(yùn)用前景。

[關(guān)鍵詞]  鈦；表面改性；細(xì)胞黏附；細(xì)胞增殖

種植體與骨之間形成良好骨整合是植入成功的關(guān)鍵，而骨整合取決于材料表面化學(xué)特征和形貌。利用表面改性對(duì)鈦表面進(jìn)行處理，以提高種植體骨結(jié)合率及成功率是目前的研究熱點(diǎn)之一。羥磷灰石（hydroxyapatite，HA）是一種具有良好的生物相容性和骨引導(dǎo)作用，能促進(jìn)早期骨整合的骨仿生材料^[1]。殼聚糖（chitosan，CS）為可降解堿性多糖，具有六元環(huán)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，適于制備受力材料，具有良好的生物相容性和骨引導(dǎo)性^[2]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，調(diào)節(jié)骨的成熟、改建，對(duì)骨整合的形成有重要的作用^[3]。

本實(shí)驗(yàn)通過物理-化學(xué)-生物改性聯(lián)合的方式，在鈦表面得到HA/CS-TGF-β1緩釋微球復(fù)合涂層，研究該復(fù)合涂層對(duì)成骨細(xì)胞黏附和增殖的影響，為進(jìn)一步研究其在種植修復(fù)中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1  材料和方法

1.1  材料和儀器

TA2純鈦鈦片（寶雞英耐特醫(yī)用鈦有限公司），1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳二亞胺[1-ethyl-3-（3-dimethyl aminopropyl）carbodiimide，EDC]/N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、明膠粉劑、HA、多巴胺（Sigam公司，美國），CS（浙江金殼生物化學(xué)有限公司），TGF-β1及酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（Cloud-clone公司，美國），CCK-8試劑盒（上海碧云天生物有限公司）。QUANTA
200掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）（FEI公司，荷蘭），Magna 550型傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform-infrared spectroscopy，FTIR）（Nicolet公司，美國），p-Quant酶標(biāo)儀（Bio-Tek公司，美國），X射線衍射儀（X-ray diffraction，XRD）（Panalytical公司，荷蘭）。

1.2  方法

1.2.1  鈦片表面處理  將10 mm×10 mm×l mm純鈦鈦片經(jīng)240、400、800、1 000、1 500號(hào)砂紙逐級(jí)打磨，丙酮、乙醇清洗后，酸洗，去離子水超聲清洗3遍，干燥備用。

1.2.2  微弧氧化  使用Microarc-3.0微弧氧化機(jī)進(jìn)行微弧氧化處理：鈦片為陽極，石墨為陰極，電解液為200 mL去離子水與1 mL硫酸配置。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定微弧氧化條件：電壓200 V，電流密度6 mA·cm^-2，氧化時(shí)間180 s。

1.2.3  明膠緩釋微球的制備  將1.5 mL司盤80（Span-80）加入70 mL液體石蠟中預(yù)熱至60 ℃，快速攪拌下滴入60 ℃的明膠溶液（1 g明膠+10 mL蒸餾水），攪拌30 min，直至溶液變成乳白色，冰浴冷卻；待明膠溶液冷卻至4 ℃加5%戊二醛4 mL，交聯(lián)3 h；恢復(fù)至室溫，加入30 mL丙酮，去除油相30 min；異丙醇、乙醇洗滌，抽濾，干燥，得淡黃色粉末，備用。

1.2.4  HA/CS涂層的制備  將經(jīng)過微弧氧化處理的鈦片放入1 g·L^-1的多巴胺溶液浸泡18 h，干燥；將已溶解的HA（0.4 g HA+40 mL MES）緩慢滴入CS凝膠（1 g CS+50 mL H₂O），攪拌1 h；在干燥鈦片表面滴加該溶液，負(fù)壓處理10
min，干燥24 h。

1.2.5  EDC/NHS交聯(lián)TGF-β1蛋白  將100片已制備HA/CS涂層的鈦片分成A、B、C、D、E組，每組20片，為實(shí)驗(yàn)組。另備20片只經(jīng)1.2.1步驟處理的鈦片為對(duì)照組（F組）。備5只編號(hào)分別為A、B、C、D、E的裝有20 mL 0.1g·mL^-1 CS凝膠的燒杯，各加入0.4 g明膠微球，攪拌20 min后放入對(duì)應(yīng)的鈦片各20片，冰浴下各加入0.08 g EDC，溶解后加入0.12 g NHS，隨后立刻加TGF-β1蛋白，A、B、C、D、E組加入蛋白濃度分別為15、30、60、75、250 ng·mL^-1，交聯(lián)反應(yīng)12 h，干燥。

1.2.6  樣品檢測及體外釋藥  以SEM、XRD、FTIR等檢測涂層表面形貌、成分及親水性。從5個(gè)實(shí)驗(yàn)組中隨機(jī)取鈦片各5個(gè)，平鋪于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入1
mL PBS緩沖液，于37 ℃恒溫?fù)u床上浸泡0.6 h，暫取出試樣，吸取浸出液至EP管中，于-20 ℃的環(huán)境中保存，即為前0.6 h釋放的待測浸出液。再將試樣放回，加入PBS液1 mL，以同樣方法取1、3、5、7、9、11、14 d的浸出液并保存。浸出液樣品稀釋為10%，據(jù)TGF-β1蛋白ELISA試劑盒操作說明，于波長450 nm時(shí)測定標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品的光密度（optical density，OD）值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線計(jì)算材料14 d內(nèi)的釋藥量。

1.2.7  成骨細(xì)胞增殖與毒性研究  采用CCK-8法，取雙抗滅菌后各組鈦片各5片平鋪于48孔培養(yǎng)板（鈦片與孔直徑相當(dāng)）。分離大鼠成骨細(xì)胞并進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)，將P2代的細(xì)胞懸液按每孔100 μL接種于各組，37 ℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；于1、3、7 d分別取出培養(yǎng)板，每孔加CCK-8試劑溶液20 μL，37 ℃下孵育2.5 h后每孔取110 μL液體到96孔板內(nèi)，酶標(biāo)儀450 nm測定各孔OD值。

1.2.8  成骨細(xì)胞的黏附與增殖  將成骨細(xì)胞按每孔1×10³個(gè)細(xì)胞密度接種于各組材料表面，每孔100 μL細(xì)胞懸液，補(bǔ)足含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，“8”字搖勻后放入37 ℃孵育箱。分別培養(yǎng)6 h及3 d后，吸出培養(yǎng)液，常溫PBS反復(fù)沖洗3次，加入200 μL2.5%的戊二醛4 ℃下固定15 min，吸出戊二醛，加入4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染料孵育20 min，PBS沖洗3次，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，定量資料采用描述，統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析，組間比較采用SNK（Student-Newman-Keuls test）法，檢驗(yàn)效能α=0.05。 

2  結(jié)果

2.1  處理后鈦片的表面形貌

鈦表面微弧氧化后的SEM圖像見圖1。由圖1可見，鈦表面形成大小和間距基本一致的小微孔，較大微孔孔徑約1 μm，較小微孔孔徑約20 nm，孔洞占有率平均為13.022%。載TGF-β1蛋白的明膠微球表面形貌見圖2。由圖2可見，復(fù)合涂層載TGF-β1蛋白的明膠微球表面呈圓球型，粒徑較均勻，未見微孔和裂紋。測得明膠微球粒徑為8~30 μm，占表面的92.323%，平均粒徑為（18.36±3.07）μm。 

2.2  XRD、FTIR檢測結(jié)果

由XRD圖譜可見，未經(jīng)處理的鈦片出現(xiàn)明顯的鈦基峰，僅存在很弱的銳鈦礦型二氧化鈦峰；而經(jīng)微弧氧化后，樣品表面銳鈦礦型和金紅石型的二氧化鈦峰均相當(dāng)明顯，鈦基峰明顯減弱；當(dāng)鈦表面制備HA/CS-TGF-β1緩釋微球復(fù)合涂層后，基體鈦峰幾乎被湮沒，2θ=31.7°出現(xiàn)特征峰，這與HA標(biāo)準(zhǔn)粉末衍射數(shù)據(jù)譜峰的（211）晶面的特征峰位置吻和，且2θ在15°~30°范圍內(nèi)出現(xiàn)CS的特征峰（圖3）。FTIR圖譜可在1 641~1 667 cm^-1處對(duì)應(yīng)酰胺基團(tuán)，證明涂層表面存在大分子多肽。3 593 cm^-1處對(duì)應(yīng)非水羥基的振動(dòng)吸收峰，可證實(shí)HA官能團(tuán)在涂層中存在（圖4）。

2.3  接觸角

未處理的鈦表面接觸角為68.2°±1.5°；經(jīng)多巴胺和微弧氧化處理后接觸角為26.8°±1.3°.。HA/CS-TGF-β1緩釋微球復(fù)合涂層制備完成后接觸角幾乎為零，即具有超親水性。

2.4  體外釋藥

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品TGF-β1蛋白濃度的OD值，得到標(biāo)準(zhǔn)品曲線y=3.885 5x+0.275 2，將樣本OD值代入，可得A、B、C、D、E組平均釋放濃度分別為（0.485±0.022）、（0.976±0.021）、（1.992±0.023）、（2.493±0.022）、（8.011±0.019）ng·mL^-1。HA/CS-TGF-β1體外釋藥情況見圖5。由圖5可見，6 h、1 d、7
d、14 d時(shí)釋放量分別達(dá)（25.3±1.8）%、（30.1±1.7）%、（58.4±1.8）%、（80.1±1.9）%。

2.5  成骨細(xì)胞增殖測定

通過CCK-8檢測大鼠成骨細(xì)胞于1、3、7 d后的相對(duì)增殖率（圖6）。1 d時(shí)各組之間差異不明顯（P>0.05）；3 d時(shí)，各組細(xì)胞數(shù)量均有明顯增長，且實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞密度大于對(duì)照組的細(xì)胞密度（P<0.05），B、C組細(xì)胞增殖大于其他組；7 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖情況明顯優(yōu)于對(duì)照組（P<0.05)，B、C組細(xì)胞增殖明顯大于其他組（P<0.05)，E組細(xì)胞密度小于其他實(shí)驗(yàn)組（P<0.05)。

2.6  成骨細(xì)胞的黏附和增殖

DAPI染色發(fā)現(xiàn)：接種6 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量無明顯差距；在3 d時(shí)，各組均有明顯增殖，B、C組尤其明顯，E組細(xì)胞數(shù)量少于其他實(shí)驗(yàn)組，但所有的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量均高于對(duì)照組（圖7）。

3  討論

通過表面改性使種植體具有生物功能性，從而縮短種植周期，獲得早期骨整合和更高的結(jié)合強(qiáng)度是口腔材料研究的熱點(diǎn)。由于種植適應(yīng)證的擴(kuò)大，尤其是運(yùn)用于全身性疾病如糖尿病、骨質(zhì)疏松等的患者時(shí)，單一的鈦種植體材料表面改性和簡單的制備工藝已不能滿足目前的臨床要求，結(jié)合物理、化學(xué)、生物化學(xué)方法及材料優(yōu)點(diǎn)的改性技術(shù)是今后提高種植體表面活性的必然趨勢^[4]。

目前，化學(xué)改性如離子噴涂HA涂層已廣泛應(yīng)用于種植領(lǐng)域，取得了一定的效果^[5]，但離子噴涂設(shè)備成本高且在骨-涂層-金屬界面存在著涂層不均一、易剝脫等問題^[6]。因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)制備HA層進(jìn)行了改進(jìn)：通過微弧氧化在鈦片形成的微孔，引入納米級(jí)HA和CS形成膠體液涂在鈦片表面，再通過加熱，形成一層結(jié)合牢固的HA薄膜，并使用多巴胺將其緊黏附于鈦片表面，通過負(fù)壓處理使HA/CS復(fù)合涂層充分滲入鈦內(nèi)部，從而克服了傳統(tǒng)涂層易于脫落的缺點(diǎn)。同時(shí)，Meirelles等^[7]研究也證明了鈦種植體表面納米HA涂層的骨接觸率明顯高于普通HA涂層。

本實(shí)驗(yàn)使用明膠微球吸附TGF-β1，形成微球控制釋放系統(tǒng)，又通過EDC/NHS直接交聯(lián)TGF-β1蛋白，大幅度提高了載藥量，再通過CS凝膠將整個(gè)復(fù)合涂層形成整體，將明膠微球包裹于內(nèi)，形成緩釋系統(tǒng)。涂層的蛋白釋放速率主要取決于蛋白擴(kuò)散速度和材料降解速度，而明膠微球在pH>7時(shí)完全降解約需2個(gè)月左右，且大分子肽類物質(zhì)自微球向外部擴(kuò)散速度較慢^[8]；EDC/NHS交聯(lián)后涂層穩(wěn)定性增強(qiáng)，抵抗酶解的能力顯著增加；凝膠體系的降解速度較慢；這些因素都決定了此復(fù)合涂層具有良好的緩釋性能。通過體外釋藥實(shí)驗(yàn)可見，除釋藥初期具有“突釋”效應(yīng)，以后蛋白釋放逐漸平緩。有研究^[9]報(bào)道可利用層-層自組裝的方法，通過帶相反電荷的聚電解質(zhì)在材料表面交替沉積形成聚電解質(zhì)多層膜來調(diào)節(jié)多層膜的厚度及多層膜中附載的物質(zhì)及其釋放速度，因此筆者也考慮在下一步的研究中利用CS和明膠在鈦種植體表面制備聚電解質(zhì)多層膜，在多層膜中附載蛋白，來解決“突釋”問題。

良好親水性的表面與細(xì)胞黏附有密切關(guān)系，親水性的樣品表面有利于從所處的周圍環(huán)境中吸附蛋白質(zhì)和具有極性或者離子性的營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而影響細(xì)胞的黏附與增殖和分化。本實(shí)驗(yàn)制備的復(fù)合涂層具有超親水性，由細(xì)胞的黏附與增殖實(shí)驗(yàn)可以看出該涂層確實(shí)有利于細(xì)胞的增殖；同時(shí)由于鈦片表面存在微孔、HA、明膠微球等，使復(fù)合涂層具有粗糙多孔的微觀結(jié)構(gòu)，更利于細(xì)胞的早期黏附。

HA/CS-TGF-β1緩釋微球復(fù)合涂層能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖生長，且TGF-β1蛋白釋放濃度在一定范圍內(nèi)時(shí)，此作用尤為明顯。證明TGF-β1蛋白釋放濃度在低濃度時(shí)促進(jìn)細(xì)胞的增殖，在高于10 ng·mL^-1時(shí)，將抑制細(xì)胞增殖，卻促進(jìn)細(xì)胞的分化^[10]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對(duì)傳統(tǒng)的表面改性進(jìn)行改進(jìn)，改性過程中基本未引入可能產(chǎn)生生物學(xué)危害的物質(zhì)且改性后的表面具有多功能性，在體外對(duì)于成骨細(xì)胞的黏附與早期增殖具有明顯的促進(jìn)作用。但生物體體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，因此復(fù)合涂層的體內(nèi)釋藥及生物功能還需進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。